Effect of solid phase extraction column on determination of morphine in compound liquorice oral solution

安捷伦1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Simplicity纯水仪（美国Millipore公司）。复方甘草口服溶液（批号：20211231、20220323、20220507，联勤保障部队第九〇〇医院药剂科）、吗啡对照品（批号：171201-200521，中国药品生物制品检定所），甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。C₁₈固相萃取柱（规格：100、200、250、500 mg，江苏绿盟科学仪器有限公司）。

根据《中华人民共和国药典》2020年版的规定，本品每1 ml 中含无水吗啡（C₁₇H₁₉NO₃）应为0.0765～0.1040 mg。

色谱柱：依利特C₈色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙腈-2.5 mmol/L庚烷磺酸钠溶液-50 mmol/L磷酸二氢钾溶液（5∶18∶18）；流速: 1 ml/min；检测波长：220 nm；进样量：20 μl；柱温：30℃。

精密称定吗啡对照品10 mg置于100 ml量瓶中，用5%的醋酸溶液溶解，稀释至刻度，作为对照品储备液。精密量取上述溶液2.5 ml置于25 ml量瓶中，加5%醋酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

按照复方甘草口服溶液处方，将其中含有吗啡的复方樟脑酊除去，其余按照处方标准，制成阴性对照溶液。

取固相萃取柱，依次用甲醇-水（3∶1）15 ml 与水5 ml 冲洗，再用pH 值约为9 的氨水溶液（取水适量，滴加氨试液至pH 值为9）冲洗至流出液pH 值约为9，待用。

取本品，超声10 min， 取出摇匀；精密量取0.5 ml置于处理后的固相萃取柱上，滴加氨试液适量使柱内溶液的pH 值约为9，用水20 ml 淋洗，弃去淋洗液，用5% 醋酸溶液洗脱，用5 ml 量瓶收集洗脱液至刻度，摇匀。

选择国产品牌的市售不同填料含量的C₁₈固相萃取柱，按“2.3.3”项下操作。对比4种不同填料含量的固相萃取柱对复方甘草口服溶液吗啡含量测定的影响，每种填料含量的固相萃取柱各取6支。如表1所示，在填料量为100 mg和200 mg时，固相萃取柱对复方甘草口服溶液吗啡的提取不完全，在250 mg 和500 mg填料含量规格时吗啡可以被固相萃取柱完全吸附，但是250 mg规格已停产市面上不再售卖。因此本实验最终选择使用500 mg的固相萃取柱进行复方甘草口服溶液吗啡含量测定。精密量取吗啡对照品适量，置于500 mg固相萃取柱中，每种浓度的吗啡对照品各取6份。活化和分离步骤按“2.3.3”项下操作，计算回收率和RSD值。如表2所示，500 mg填料含量固相萃取柱对吗啡回收率良好。

根据上述实验选出的填料含量，按“2.3.3”项下方法处理同一批次的3份复方甘草口服溶液（批号：20220323）并分别重复使用，计算吗啡的平均含量和RSD值，探究其最大使用次数。如表3所示，固相萃取柱在前3次使用时含量同第1次并无明显区别。但在第4次使用检测时发现，固相萃取柱的吗啡含量均小于前3次测量的吗啡含量，同上一次相比下降了8%，且在第5次重复使用时测得的吗啡含量与前3次相比下降了15%。因此，固相萃取柱最多只可重复使用3次。

通过固相萃取加压装置控制流速与常压下流速进行比较，按“2.3.3”项下方法处理复方甘草口服溶液（批号：20220323）。如表4所示，在加压下，流速在0.5～30 ml/min之间所测得的供试品吗啡浓度呈不断下降的趋势。流速越快，吗啡含量越低。在控制流速为0.5 ml/min时吗啡含量测得与常压下0.24 ml/min测得的吗啡含量无明显的差异，且能显著提高检测效率。因此本实验选择在加压条件下控制流速约为0.5 ml/min进行对复方甘草口服溶液吗啡含量测定。

综上所述，本实验建议选用国产品牌500 mg的固相萃取柱在加压下控制流速约为0.5 ml/min进行复方甘草口服溶液吗啡的含量测定。现就此方法进行方法学验证。

取0.1 mg/ml的吗啡对照品0.5 ml置处理后的固相萃取柱上，按照供试品溶液相同的洗脱条件洗脱，收集洗脱液5 ml，摇匀，作为固相萃取柱系统适用性溶液。精密量取该溶液与对照品溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。根据峰面积测得固相萃取柱系统适用性试验结果（fs）为0.99，符合规定要求（fs值应在0.97～1.03之间）。

由图1所示，吗啡对照品溶液中吗啡在5~6 min时出峰，供试品溶液在此处有吗啡峰，而阴性对照在此时间段无吗啡峰，本实验专属性良好。

精密量取吗啡对照品储备液适量置50 ml量瓶中，加5% 醋酸溶液稀释至刻度，配制成浓度为2、5、10、16、20、30 µg/ml的标准曲线工作液，按“2.2”项下的色谱条件进行测定。以吗啡的浓度（µg/ml）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得Y=55.19 X−14.12（r=0.999 5），线性关系良好。

取吗啡对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果显示吗啡峰面积的RSD为0.27%，表明仪器精密度良好。

取同一份供试品溶液（批号：20220323），分别于 0、2、4、6、8、10、12 h，按“2.2”项下色谱条件进样测定峰面积，吗啡峰面积的 RSD 为 1.06%，结果表明供试品溶液在 12 h 内稳定。

取同一批次的复方甘草口服溶液（批号：20220323）6份，按照“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定峰面积，结果显示吗啡峰面积的RSD值为1.05%，表明方法重复性良好。

精取量取已知含量的同一批次复方甘草口服溶液（批号：20220323）0.25 ml于固相萃取小柱内，共9份，分别精密加入低、高、中3个不同浓度（相当于吗啡含有量的80%、100%、120%）的吗啡对照品储备液（每个浓度各3份），按“2.3.3”项下供试品的制备方法操作，按“2.2”项下的色谱条件测定，记录吗啡峰面积并计算回收率。结果显示，吗啡的平均回收率分别为98.1%、98.3%、98.5%，RSD值分别为1.21%、0.63、0.45%，表明试验回收率良好。

精密量取3个批号复方甘草口服溶液（批号：20211231、20220323、20220507），按照“2.3.3”项下处理制备供试品溶液，按“2.2“项下条件测定，每个批号平行测定3次。测得吗啡平均含量分别为0.086 9、0.087 3、0.087 1 mg/ml。

综上所述，使用该国产品牌500 mg的固相萃取柱在加压下控制流速约为0.5 ml/min进行复方甘草口服溶液吗啡的含量测定，方法学验证效果良好，在此固相萃取柱使用条件下测定复方甘草口服溶液吗啡的含量方法可行，此方法可用于本院制剂复方甘草口服溶液吗啡含量测定。

市场上的固相萃取柱品牌多样，同样规格的C₁₈固相萃取柱，不同厂家的价格具有非常大的差异，国外进口品牌的固相萃取柱价格是国产品牌的3～4倍^[6-8]。固相萃取柱填料量少则会导致吗啡无法完全提取含量测定不准确，填料过多则会导致吗啡的含量测定费时费力^[9]。固相萃取柱使用成本较高，且通常使用一次就丢弃，若固相萃取柱重复多次使用，可大大对降低检测成本。此外，日常对复方甘草口服溶液吗啡含量测定时，使用固相萃取柱提取吗啡基本需要2 d的时间，给吗啡的含量测定效率产生很大的影响，延长了制剂检测报告和投入临床使用的时间。加压又可能因流速过快导致目标化合物在固相萃取柱内保留的不充分，随杂质一起流失，因此在保证复方甘草口服溶液吗啡回收率的前提下筛选出最佳流速可明显提高复方甘草口服溶液中吗啡含量测定的效率^[10-13]。

本实验选用国产品牌500 mg的固相萃取柱在加压下控制流速约为0.5 ml/min进行复方甘草口服溶液吗啡的含量测定，且固相萃取柱可以重复使用3次。实验经方法学验证效果良好，可用于复方甘草口服溶液吗啡含量测定，既节约了价格成本，又缩短了制剂检测和投入临床使用的时间，对本院制剂复方甘草口服溶液吗啡含量测定具有重要的现实意义。