HPLC fingerprint of Radix Rhubarb and forbidden pesticide residues

SHIMADZU 20AT HPLC仪（日本岛津公司）；XS105万分之一分析天平[Mettler-Toledo international trading（Shanghai）co., Ltd.]；电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。Agilent 1260-6470 QQQ三重四极杆质谱仪，Agilent 8890-7000D气相色谱仪-三重串联四极杆质谱仪；LC-SFJ-10型手持高速匀浆机；GIPP型水浴氮吹仪；RG-160AT型离心机；Direct-Q3UV型超纯水机；XS105型电子天平；RE-52A型旋转蒸发仪；Vortex-250OMT型多管旋涡混合仪；WSZ-200A型振荡器。

芦荟大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110795-202011，纯度：97.5%），大黄素甲醚对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110758-201817，纯度：99.2%），大黄酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110796-201922，纯度：99.4%），大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110756-201913，纯度：96.0%），禁用农药混合对照溶液（中国食品药品检定研究院，批号：610020-202202），甲醇为分析纯（杭州高晶精细化工有限公司）；磷酸为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；色谱纯乙腈 、甲醇（上海星可高纯溶剂有限公司）；其余试剂均为分析纯。

20批大黄药材分别采集于甘肃、青海、四川、湖北，大黄药材经嘉兴东方国药饮片股份有限公司朱涛副主任药师鉴定为蓼科大黄属植物掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄的干燥根和根茎，见表1。

精密称取大黄粉末0.5 g（过四号筛），置具塞锥形瓶中，精密加入25 ml分析纯甲醇，称定重量，水浴加热回流1 h，放冷，用分析纯甲醇补足减失的重量，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

精密称取芦荟大黄素对照品、大黄素甲醚对照品、大黄酚对照品、大黄素对照品适量，加色谱纯甲醇制成每1 ml含芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄素各16 μg的混合溶液，摇匀，备用。

色谱柱：Silversil C₁₈（4.6 mm×250 mm, 5 μm）；以色谱纯甲醇为流动相A，以0.1 %磷酸溶液为流动相B，按照表2进行梯度洗脱；流速为1.0 ml/min；检测波长为254 nm；柱温为35 ℃；进样量为10 μl。

（1）空白试验

吸取分析纯甲醇，在“2.1.3”色谱条件下测定，未见干扰。

（2）精密度考察

按“2.1.1”项下方法制备编号为1的掌叶大黄供试品溶液，按“2.1.3”色谱条件，连续进样6 次 ，记录液相色谱图，计算精密度。以9号峰（芦荟大黄素）为参照峰，各共有峰保留时间的RSD值为0.02 %~0.04 %，峰面积的RSD值范围为0.04 %~0.73 %，均小于2 %。表明仪器精密度良好。

（3）稳定性考察

取编号为1的掌叶大黄，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，放置0、2、4、6、8、10、12 h并按“2.1.3”色谱条件进样，以9号峰（芦荟大黄素）为参照峰，各共有峰保留时间的RSD值为0.02 %~0.04 %，峰面积的RSD值范围为0.32 %~1.70 %，均小于2 %，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

（4）重复性考察

取编号为1的掌叶大黄，按“2.1.1”项下方法制备 6 份供试品溶液，按“2.1.3”色谱条件进样测定，以9号峰（芦荟大黄素）为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD值范围为0.03 %~0.07 %，峰面积的RSD值范围为0.45 %~1.54 %， RSD值均小于2 %，表明该方法重复性良好。

取不同来源的大黄样品20批（表1），按“2.1”项下方法制备大黄供试品溶液并进样测定，得到20批大黄样品色谱图，图谱显示掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄3种来源大黄的液相色谱图差异较大，每个来源大黄的色谱图之间差异较小，将色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，共标定12个共有特征峰，分别以每个来源样品的色谱图为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度为0.1，得到3种来源大黄的HPLC对照图谱，见图1～图2。相似度评价结果见表3～表5。大黄样品与其对照指纹图谱的相似度均>0.95，说明同一来源大黄样品的质量比较接近。

根据保留时间比对确定共有指纹峰，对20批大黄HPLC指纹图谱测定结果进行比较分析，确定12个共有指纹峰。通过与对照品的保留时间比对，确定大黄图谱9号峰为芦荟大黄素, 10号峰为大黄素，11号峰为大黄酚，12号峰为大黄素甲醚。

采用组间联接法，以峰面积为变量，用SPSS 26.0软件对20批大黄进行聚类分析。由聚类分析树状图可知， 20批不同样品可聚为3类，5批唐古特大黄S1 、S2 、S3 、S4、S5聚为一类，药用大黄S6、S7、S9、S11聚为一类，药用大黄S8、S10、S12、掌叶大黄S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20聚合为一类。聚类分析树状图见图3。

参照《中国药典2020年版》四部2341农药残留量测定法测定。

（1）气相色谱质谱条件

色谱条件：用（50%苯基）-甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱（柱长30 m，膜厚度0.25 µm，柱内径0.25 mm）。进样口温度为250 ℃，不分流进样。载气为高纯氦气。进样口为恒压模式，柱前压力为146 kPa。程序升温：设定初始温度为60 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升至120 ℃，再以10 ℃/min升至160 ℃，再以2 ℃/min的速率升温至230 ℃，最后以15 ℃/min升温至300 ℃，保持6 min。

质谱条件：以三重四极杆串联质谱仪检测；离子源为电子轰击源，离子源温度250 ℃。碰撞气为氮气。质谱传输接口温度280 ℃。质谱监测模式为多反应监测。

（2）液相色谱质谱条件

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长10 cm，粒径2.6 µm，内径2.1 mm）；以0.1 %甲酸溶液（含5 mmol/L甲酸铵）为流动相A，以乙腈-0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L甲酸铵）（95∶5）为流动相B，按下表6进行梯度洗脱；流速为0.3 ml/min，柱温为40 ℃。

质谱条件：以三重四极杆串联质谱仪检测；离子源为电喷雾离子源，正离子扫描模式。监测模式为多反应监测。

（1） 提取

取过三号筛的大黄粉末5 g，精密称定，加1 g氯化钠，立即摇散，再加入50 ml乙腈，匀浆处理2 min（转速不低于12 000 r/min），再至4 000 r/min的离心机中离心，取上清液，剩余沉淀再加50 ml乙腈，匀浆处理1 min，再离心，合并两次提取的上清液，减压浓缩至约5 ml，用乙腈稀释至10 ml，摇匀，即得。

（2）净化

①气相色谱-串联质谱法：量取乙腈：甲苯（3∶1）10 ml过SelectCore GCB/NH2-A固相萃取柱 （500 mg/500 mg/6 ml）（纳谱分析）活化，溶液弃去，精密量取“提取”中制备的供试品溶液2 ml置萃取柱上，待萃取小柱中样品液全部通过，用20 ml乙腈：甲苯（3∶1）洗脱，收集全部洗脱液，40 ℃以下减压回收至近干，用乙腈稀释至2.0 ml，混匀，即得。②高效液相色谱-串联质谱法：量取上述供试品溶液3 ml，通过亲水亲油平衡材料SelectCore HLB-B固相萃取柱（200 mg，6 ml）（纳谱分析）净化，收集全部净化液，即得。

（1）混合对照品溶液的制备

取已知浓度的禁用农药混合对照品溶液（已标示各相关农药品种的浓度），精密量取1 ml，置20 ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

（2）气相色谱-串联质谱法分析用内标溶液的制备

精密称取磷酸三苯酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并制溶解并制成每1 ml含l.0 mg的溶液。精密量取适量，加乙腈制成每1 ml含0.1 µg的溶液。

（3）空白基质溶液的制备

取不含农残的空白大黄基质样品，同供试品溶液的制备方法处理，得到空白基质溶液。

（4）基质混合对照溶液的制备

精密量取上述空白基质溶液1.0 ml（6份），置40 ℃水浴氮吹仪上，氮吹浓缩至约0.6 ml，分别加入混合对照品溶液10、20、50、100、150、200 µl，加乙腈稀释至1 ml，混匀，即得。

（1）气相色谱-串联质谱法

分别精密吸取上述的供试品溶液和基质混合对照溶液各1 ml，分别精密加入内标溶液0.3 ml，混匀过滤，取续滤液。分别精密吸取上述两种溶液各1 µl，注入仪器，按内标曲线法计算，即得。

（2）高效液相色谱-串联质谱法

分别精密吸取上述的基质混合对照溶液和供试品溶液各1 ml，精密加入水0.3 ml，混匀过滤，取续滤液。分别精密吸取上述两种溶液各1 µl，注入仪器，按外标曲线法计算，即得。

（1）标准曲线

将33种禁用农药的基质混合溶液，按照“2.3.4”项下方法进行测定，以不同农药的质量浓度为横坐标，对应的响应值为纵坐标，绘制工作曲线。结果表明：33种禁用农药的质量浓度在线性范围内与其对应的响应值呈线性关系，线性参数表见表7。

（2）回收率和重复性实验

以空白大黄样品6份为基质，分别加入混合对照品溶液200 µl到样品中，做加标回收试验，根据实际曲线得到的响应值结果与理论值进行计算33种禁用农药的回收率和回收率的相对标准偏差（RSD）。结果表明：33种禁用农药的平均回收率为62.1%~101.3% ，回收率的 RSD为1.12%~10.26%。结果见表8。

按照以上前处理方法对20批大黄样品进行测定，检测结果表明禁用农药均未检出。本研究显示该方法快速、高效和准确，可以作为日常药材监管和检验依据，对大黄中农药残留进行安全评估。

本研究建立了20批不同产地不同种源大黄的指纹图谱，采用指纹图谱软件共标定出12个共有指纹峰。通过与对照品的色谱峰保留时间比对，4个色谱峰得到确认。生成3种不同来源大黄的指纹图谱，每一类大黄与其对照指纹图谱的相似度均大于0.95，说明建立的大黄指纹图谱方法具有较好的稳定性和可控性，能为质量评价提供参考依据。通过聚类分析将20批大黄分为3类，5批唐古特大黄S1 、S2 、S3 、S4、S5聚为一类，药用大黄S6、S7、S9、S11聚为一类，药用大黄S8、S10、S12、掌叶大黄S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20聚合为一类，表明大黄药材的内在质量与大黄种属有一定的关联，可能还与产地，海拔，种植环境有关。综上所述，本研究所建立的不同来源大黄指纹图谱准确度高，灵敏度高，专属性强，可以为大黄的质量控制提供可靠依据。同时本研究建立了大黄中33种禁用农药检测方法，结果显示所有大黄样品均未检出禁用农药，风险较小。结果显示，该方法操作简单、重复性好，可用于大黄的禁用农药残留筛查。