Establishment of quality standard of Bletilla compound spleen-tonifying Traditional Chinese Medicine

LC-15C高效液相色谱仪（日本岛津公司）；紫外检测器；白及复方补脾中药（自制，批号：220205、220206、220209）；没食子酸对照品（含量高于89.9%，产品批号：110831-201202，中国食品药品检定研究院）；蒲公英（批号：B22122901-01，产地河北）、茯苓（批号：B22091301-01，产地湖北）、地榆（批号：B22112301-1，产地湖北）、党参（批号：B22110701-01，产地甘肃）、白术（批号：B22091502-01，产地安徽）、白头翁（批号：B22061601-01产地湖北）、甘草（批号：B22120801-01，产地新疆），以上所有饮片均由河北楚风中药饮片有限公司供应；白及（批号：20220224，产地贵州），由吉林省北药中药制药集团有限公司提供；经本院药剂科孙国才主任中药师鉴定，均符合《中国药典》规定；实验中所用甲醇为色谱级，其他试剂均是分析纯。

取本品5 g（批号：220205），加正己烷20 ml，超声处理20 min后，4 ℃过夜，过滤，滤液浓缩至约3 ml，作为供试品溶液。再以同法将白术对照药材与不含白术的其他药材制成对照药材溶液、阴性对照溶液。各吸取20 μl于硅胶G薄层板点样，以石油醚（60~90 ℃）-甲苯-乙酸乙酯（15∶2∶1）为展开剂，展开完全后取出硅胶G薄层板，晾干，10%硫酸乙醇溶液显色，于90 ℃加热处理5 min，紫外灯（365 nm）下观察。供试品与白术对照药材在相应部位上，显相同颜色的明亮斑点（白术内酯），阴性对照无干扰。见图1。

取本品5 g（批号：220205），加乙醇50 ml，水浴煮沸15 min，滤过，滤液浓缩至约2 ml，作为供试品溶液。再以同法将党参对照药材与不含党参的其他药材制成对照药材溶液、阴性对照溶液。各吸取10 μl于硅胶G薄层板上点样，以氯仿-甲醇-水（14∶7∶1）为展开剂，完全展开后取出薄层板，晾干，3%硫酸乙醇溶液显色。供试品与党参对照药材在相应的部位上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。见图2。

取本品5 g（批号：220205），加70%乙醇50 ml，超声处理20 min，滤过，滤液浓缩至约1 ml，作为供试品溶液。再以同法将白头翁对照药材与不含白头翁的其他药材制成对照药材溶液、阴性对照溶液。各吸取20 μl于硅胶G薄层板点样，以氯仿-甲醇-水（7∶3∶1）为展开剂，待充分展开后，将硅胶G薄层板取出，晾干，10%硫酸乙醇溶液在105 ℃下显色。供试品与白头翁对照药材在相应的部位上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。见图3。

色谱柱：Agilent TC C₁₈色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 µm）；流动相：甲醇-0.05%磷酸溶液（5∶95）；检测波长：272 nm；流速：1 ml/min；柱温30 ℃；进样量20 µl。

精密称量没食子酸对照品适量置25 ml量瓶中，加入适量的水，配制成每1 ml含179.8 μg的对照品溶液6，备用。

精密称取本品4 g，加入10%盐酸溶液50 ml，加热回流3 h，冷却后过滤置100 ml量瓶内，用适量水多次冲洗容器和剩余残渣，并将冲洗液加入量瓶内，定容，超声振荡混匀，滤过，取续滤液，即得白及复方补脾中药供试品溶液。

根据白及复方补脾中药的配方量，采用相同的工艺制备不含地榆成分的阴性对照溶液。

按上述色谱条件，精密吸取各20 µl的没食子酸对照品溶液、白及复方补脾供试品以及不含地榆的阴性样品溶液，注入液相色谱仪检测，结果阴性样品无相应色谱峰干扰。见图4。

精密吸取对照品溶液6，以水稀释成一系列浓度为3.60、8.99、17.98、35.96、89.90 µg/ml对照品溶液，作为对照品溶液1~5，按“2.2.1”项下色谱条件依次进样20 μl，以没食子酸浓度（X）为横轴，峰面积（Y）为纵轴，绘出标准曲线，回归方程为Y=64398X+8393.7（r=0.9999），结果表明，没食子酸在3.60~179.8 µg/ml范围内线性关系良好。

取对照品溶液4，按“2.2.1”项下色谱条件，重复测定6次，计算RSD为1.46%，表明本方法精密度良好。

取供试品6份（批号：220205），根据“2.2.3”项下方法制备，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，计算RSD为1.81%，表明本方法重复性良好。

取供试品溶液（批号：220209），常温放置，并在0、1、2、4、6、8 h测定。根据测定结果计算出RSD为1.75%，表明该溶液在8 h内稳定。

分别称取已知含量的样品（批号：220205）约2 g，精密称定，按照接近1:1的量加入没食子酸对照品溶液，加入到样品中，根据“2.2.3”项下方法制备样品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算平均回收率为101.12%，RSD为0.98%，结果见表1。

取3批样品（批号:220205，220206，220209），按“2.2.3”项下制备供试品溶液，进样，计算没食子酸的含量，结果见表2。

参照2020年版《中国药典》中的方法，对白术进行鉴别，以石油醚-乙酸乙酯（50∶1）为展开剂，5%香草醛硫酸溶液显色，结果不佳。后尝试以石油醚-甲苯-乙酸乙酯（15∶2∶1）为展开剂，检测结果表明，斑点的颜色明亮，阴性样品无干扰。

查阅相关文献^[8-9]，在实验中通过调整磷酸浓度，以及磷酸与甲醇的比例来确定最佳的流动相，磷酸浓度范围为0.05~0.1%，经过多次色谱分析发现，使用甲醇-0.05%磷酸（5∶95）作为流动相，可有效地将没食子酸分离出来，保留时间适中，峰形良好，因此选择甲醇-0.05%磷酸（5∶95）作为流动相。

本研究拟完成对白头翁中白头翁皂苷B4的含量测定和白术中苍术酮的鉴别研究，但因在这两项试验中均发现阴性样品对研究有干扰，方法的专属性不强，所以改为对地榆中没食子酸的含量进行测定和对白术中白术内酯进行鉴别。

综上所述，HPLC 法与TLC法可用于白及复方补脾中药的质量标准控制。