Evaluation for embryo-fetal developmental toxicity and genetic toxicity of leonurine

益母草碱（含量99.09%，复旦大学药学院，批号：20110329）。使用前以0.5% CMC-Na溶液配制成混悬液，供试；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，批号：F20100420，国药集团化学试剂有限公司）；DMSO（批号：T20101110，国药集团化学试剂有限公司）；丝裂霉素C（批号：101202，浙江海正药业股份有限公司）；环磷酰胺（ 批号：10110621，江苏恒瑞药业股份有限公司）；敌克松（批号：PS-262）、甲基磺酸甲酯（批号：129925）、4-硝基喹啉-N-氧化物（批号：N8141）、2-氨基芴（批号：A5550-0）、1,8-二羟基蒽醌（批号：S52075-139）均购自Sigma公司；大鼠肝微粒体酶S9（批号：2715，美国Moltox公司）；组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌共5支，分别为TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株，由国家上海新药安全性评价中心赠予，储存于液氮中。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞由复旦大学公共卫生学院毒理教研室赠予,储存于液氮中。

SD大鼠（SPF级），雌性100只，雄性80只。雌鼠5~6周龄，体重110~140 g；雄鼠6~7周龄，体重150~180 g（上海西普尔-必凯实验动物有限公司）；实验动物质量合格证号：2008001629237。ICR小鼠（SPF级），共46只，雌雄各半。雌鼠7~8周龄，体重21~23 g；雄鼠7~8周龄，体重23~25 g（上海西普尔－必凯实验动物有限公司）；实验动物质量合格证号：2008001610906。实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2008-0016，实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2007-0003。

按《药物生殖毒性研究技术指导原则》^[10-11]的要求，将雌鼠与雄鼠1:1合笼，交配第2天起对雌鼠进行阴道涂片检查，若显微镜下查见精子则视为交配成功，成功当天即为妊娠GD₀。然后将这部分雌鼠按体重随机分为4组，每组20只。急性毒性试验结果提示SD大鼠经口灌胃给予益母草碱，最大耐受量（MTD）>5 000 mg/kg，因此，本试验设高、中、低剂量组（2 000、1 000和500 mg/kg体重），另设溶媒对照组，分别对不同组别的雌鼠连续灌胃给药10 d（给药起止时间为GD₆~GD₁₅）。于GD₀、GD₅、GD₆~GD₁₅和GD₂₀ 时称取孕鼠的体重。在GD₂₀时处死孕鼠，观察外观是否异常，同时记录其活胎数（区分雌雄）、黄体数、着床数、死胎数等。所有的胎鼠，取其中约一半数量固定于Bouin液中作内脏检查，另一半固定于75%乙醇中制作骨骼标本，用于骨骼畸形检查。

按《药物遗传毒性研究技术指导原则》^[12-13]的要求，分别应用反映基因突变的Ames试验^[14]、反映染色体畸变的染色体畸变试验（体外培养CHO细胞）^[15]和小鼠微核试验（体内）^[16]方法。

应用TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535这5支菌株，设5个剂量组（5 000、500、50、5、0.5 μg/皿），此外还设空白对照、溶媒对照和阳性对照组，每个剂量组及对照组均设3个平行皿（具体剂量见表1）。采用标准平板掺入法，使细菌在有或无代谢活化系统S9的条件下接触受试物，并用最低极限的琼脂培养基培养48~72 h后，先用显微镜观察平皿上的菌苔生长情况，确定受试物无明显的抑菌或杀菌作用，再人工计数每皿回复突变的菌落数，记录原始数据，并计算每组的均值和标准差，与溶媒对照组进行比较^{[8, 17-18]}。重复试验一次。

在有或无代谢活化系统S9的条件下，在体外培养的CHO细胞中加入对应的不同浓度的受试物或对照品，反应体系总体积为10 ml。高、中、低剂量组受试物终浓度依次为1000、500和250 μg/ml，阳性对照组丝裂霉素C和环磷酰胺的终浓度分别为0.5、60 μg/ml，另设溶媒对照组分别作用于细胞4 h后换液，继续培养至24 h，最后收集细胞。用秋水仙碱处理所有细胞，将细胞终止在有丝分裂中期，经0.75%氯化钾低渗、1∶3醋酸甲醇固定、滴片和Giemsa染色后，在显微镜下计数和观察染色体的数量或结构是否改变^{[8, 17-18]}。

观察对象的选择为染色体分散良好、数目完整的中期分裂相细胞，采用盲法读片，受试物及溶媒对照组每组观察200个细胞，阳性对照组观察100个细胞，计数染色体或染色单体的断裂、缺失及其他类型结构异常的数目^{[8, 17-18]}（裂隙和核内复制一般不作为畸变类型），计算畸变率。

受试物采用经口灌胃的方式（与临床给药途径一致）给药，急性毒性试验结果提示ICR小鼠经口灌胃给予益母草碱，MTD>5 000 mg/kg，故高、中、低剂量分别设为2 000、1 000和500 mg/kg体重，同时设溶媒对照及阳性对照组。给药容积为10 ml/kg体重。以40 mg/kg体重的剂量腹腔注射给予环磷酰胺（阳性对照），给药容量为10 ml/kg体重。溶媒对照组以10 ml/kg体重的容积经口灌胃给予0.5% CMC-Na溶液。小鼠在给药24 h后处死，每只动物取其两侧股骨骨髓，制2张涂片，用甲醇固定，然后用pH6.8的Giemsa染液进行染色。

每只小鼠镜检1 000个骨髓嗜多染红细胞（PCE），计数含微核的PCE数（MNPCE），计算微核发生率，同时记录200个PCE计数过程中观察到的正染红细胞（NCE）的数目，并计算PCE/NCE值，以评价受试物是否有骨髓毒性^{[8, 17-18]}。

使用分析软件SPSS11.0，计量指标采用（$ \bar x \pm {\rm{s}}$）表示，各组之间的比较采用方差分析，率的比较采用χ²检验。

比较受试物各剂量组与溶剂对照组的回复突变菌落数，若某剂量组回复突变菌落数为溶剂对照组的2倍以上，呈现可重复性，并在一定的剂量范围内存在剂量-反应关系，则判断为阳性。

染色体畸变细胞的发生率须与溶媒对照组进行比较分析后方可判定，>10%者判为阳性。

采用χ²检验比较给药组与对照组之间的差异是否具有统计学意义。

益母草碱各受试剂量作用下在给药期间（GD₆~GD₁₅）、停药后（GD₁₅~GD₂₀）以及整个孕期（GD₀~GD₂₀）孕鼠的增重与对照组相比，差异均无统计学意义；各受试剂量组子宫连胎重量、子宫重量、黄体数、着床率、每窝平均活胎数、死胎数和吸收胎数、活胎率、死胎发生率、吸收胎发生率与对照组相比，差异均无统计学意义；此外，各组胎鼠均未观察到内脏和外观畸形的发生。以上研究结果提示，益母草碱在各受试剂量下未观察到明显的母体毒性、胚胎毒性和致畸作用。

由表2可见，受试物各剂量组胎鼠的体重、身长、胎盘重量及性别比例与溶媒对照组相比无明显差异，提示益母草碱在各受试剂量下未观察到明显的胎儿毒性。

由表3~5可见，受试物各剂量组胎鼠观察指标的数目及发育程度与溶媒对照组相比无明显差异，提示益母草碱在各受试剂量下对胎鼠骨骼的发育未见明显影响。

受试物各剂量组和对照组的平皿通过肉眼观察均未见污染，并且在显微镜下可见背景菌苔生长。试验结果见表6、表7，5个菌株的自发回复突变菌落数以及阳性对照品诱发的回复突变菌落数均在历史对照范围内，并且各菌株阳性对照组的回复突变菌落数与空白对照组相比显著增加，提示本试验系统符合试验要求。在最高剂量已达到5 000 μg/皿的受试条件下，未观察到受试物的抑菌现象^{[8, 17-19]}。各剂量组受试物在有或无代谢活化系统S9的条件下，对5支菌株所诱发的回复突变菌落数均与溶媒对照组的突变菌落数相近，并且未观察到明显的剂量-反应关系（表8）。

阳性对照组能够诱发受试细胞染色体的畸变率明显增高，24 h在有或无代谢活化系统S9的情况下，染色体畸变率分别为17%和18%，均>10%，为阳性结果；溶媒对照品以及250、500和1 000 μg/ml受试物在24 h、有S9组的染色体畸变率分别为1.5%、1.0%、0.5%和1.5%；24 h、无S9组的染色体畸变率分别为1.0%、1.0%、1.5%和0.5%，综上，溶媒对照组及受试物各剂量组细胞染色体畸变率均小于5%，为阴性结果^{[8, 17-18]}。

各剂量组小鼠在给药后均未见异常。微核试验阅片结果见表9。益母草碱在各受试剂量下未观察到对小鼠骨髓的抑制作用，溶媒对照组雌性和雄性小鼠骨髓的PCE微核发生率分别为4.09‰和2.94‰，阳性对照组雌性和雄性小鼠骨髓PCE微核发生率分别为15.93‰和16.28‰，与溶媒对照组相比，差异均有统计学意义，受试物在500、1 000、2 000 mg/kg剂量下对雌性ICR小鼠骨髓PCE微核诱发率分别为2.53‰、2.16‰和2.17‰，对雄性ICR小鼠骨髓PCE微核诱发率分别为0.78‰、0.79‰和2.96‰，由上述结果可见，受试物各剂量组均未诱发ICR小鼠骨髓PCE微核率的明显增高^{[8, 17-18, 20]}。

益母草作为传统中药，其应用广泛且历史悠久，主要用于治疗月经不调、痛经、恶露等妇科疾病，同时还用于消肿化瘀、排水利尿。而现代医学已证明益母草中的生物碱——益母草碱在其中发挥了主要功效，益母草碱具有溶栓、抗凝、降低血脂和血液黏度、抑制红细胞和血小板聚集^[2]等多种功能，对改善微循环、抗自由基活性和减少细胞内钙超载^[3-4]也有显著作用。上述功能有助于预防心血管疾病和脑血管疾病，抑制心肌纤维化^[7]、改善认知、促进神经元修复^[21]、抗炎^[22]、防治糖尿病^[23]等，因此，益母草碱在心脑血管、代谢病、肾病、生殖^[24]等临床研究领域有相当广泛的应用前景^[5-7]。进行安全性评价是药物研发和安全使用的重要环节，但目前对益母草碱的基础毒性和特殊毒性的研究尚未见相关文献报道。研究其遗传毒性和生殖毒性对于临床安全用药具有重要的指导意义。

本研究采用国际通用的研究方法，对益母草碱的生殖毒性和遗传毒性进行了系统的评价。在胚胎-胎仔发育毒性研究中，自大鼠胚胎着床至硬腭闭合这个阶段孕鼠口服益母草碱，通过观察受试物对妊娠动物、胚胎及胎仔发育的影响检测其致畸性。药物遗传毒性的研究根据国家相关标准，必须遵循原核生物与真核生物、体内系统与体外系统相结合的原则进行，本研究采用Ames试验、体外CHO细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验三者标准组合方案，其检测范围涵盖了基因突变、染色体结构和数目畸变等多个遗传学终点。Ames试验用于检测DNA损伤引起的基因突变，组氨酸营养缺陷型（his-）鼠伤寒沙门菌在受到诱变剂作用后会发生大量回复突变，可自行合成组氨酸，形成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化后才具有致突变作用，因此，在测试系统中又设置了平行组加入哺乳动物微粒体酶，以弥补体外试验缺乏代谢活化系统的不足。染色体畸变试验常用于检测化合物是否引起细胞染色体结构和数目的改变。诱变因素在损伤染色体的同时也可能损伤纺锤体，从而导致染色体的丢失并形成微核，应用微核试验检测染色体或有丝分裂器的损伤，具有直观、简便等优势^[9]。

研究结果显示，在本试验剂量条件下，益母草碱未观察到明显的胚胎-胎仔发育毒性以及遗传毒性，该结论可为益母草碱在临床上的安全使用提供参考和指导，有助于降低用药风险。