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军事药学是关于防治特种及常规武器伤和防治军队特殊环境引发疾病所用药物的研究、生产、储运、供应和使用的科学[1]，是军事医学、药学和卫生勤务学融合交叉的学科。军事药学实践可以追溯到春秋战国时期[2]，但军事药学学科的形成不过几十多年的时间。1988年德国学者Heuck主编出版的《军事药学》一书可以说标志着军事药学学科的初步形成，该书详细介绍了药材保障的组织管理、军事药学的化学技术、军事医学技术等多方面的理论和实践知识[3]。随着军事药学学科的发展，学术交流日益频繁，国际药学联合会在药学科学委员会下增设了军事与急救药学委员会[4]，中国药学会也在20世纪90年代下设了军事药学专业委员会，定期召开涉及战伤救治、灾害救援等相关的药学理论与实践的学术交流活动，以此促进军事药学研究与药材保障水平。因此，对军事药学进行科学分类，确定军事药学各分支的目标、功能、作用、地位、关系，有助于提高对军事药学的认识，引导军事药学相关学科的培育、研究和实践、论证与决策，优化军事药学资源配置，促进军事药学学科的系统化发展与完善。
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军事药学研究对象是用于防治战伤和军事特殊环境下发生的创伤和疾病的药物，是军队卫勤保障、健康服务、野战作战等能力的有力保障和物质基础。军事药学与一般药学都具有基于人的健康和疾病用药的共同特征，两者本质上具有内在一致性，从而形成了统一的药学学科。作为药学与军事学的交叉融合学科，军事药学受到军事学影响体现在军事药学的研究对象、价值取向、保障方向等方面。尽管具有如战伤救治药物、特殊环境防治药物的某些特定的军事特征，但这些特殊仍然改变不了军事药学基于人的健康与疾病用药的药学属性。因此，军事药学不是军事学的分支学科，而是药学的综合性分支学科，它是对原有的药学学科的某一方面或某一部分进行深入研究而产生的学科，针对的是战伤救治、军事特殊环境所致疾病防治药物为对象的特定药学。
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“军事药学”是一个偏正词组，“军事”作为定语，界定了“药学”的内涵。军事实践、军事需求是军事药学的发展与进步的动力，也是区别于一般药学的重要特征。军事药学根据军事行动或作战需求，为多样化军事行动提供必要的各项卫勤物资保障。从传统意义上讲，军事药学的科研、教学、学术等活动都归入后勤范围，成为军事后勤体系的重要组成部分。但实际上与其他军用物资后勤保障特点相比较，军事药学品种复杂，精准性、时效性明显高于其他后勤物资。随着科学技术的发展，武器装备的更新和作战样式的变化，军事药学的地位和作用也日益增强。军事药学不仅仅是对战伤救治所需药品的被动药材保障，还在人机工效、神经认知、催眠促醒、健康维护等方面，具有积极主动地维持或提升作用。军事药学能力已成为战斗力要素之一，呈现出由后方阵地向战场前沿，由被动保障向主动干预的全过程、全方位、全要素的特征。
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军事医学是研究军事活动条件下，对有生力量健康保护、伤病防治、提高作业效能的理论、技术和组织管理的特种医学[7]。而军事药学的使命是将生命科学和军事医学的技术、理论、方法转化为药品、给药技术和用药监护，从而满足军队卫勤保障的药物需求。军队特需药品是军事药学研究的对象，也是军事医学主要研究领域之一。军事药学作为军事医学共性基础学科群之一，是生命科学和军事医学学科体系重要的组成部分。随着高新技术武器装备的发展，高技术信息化局部战争条件下的致伤特点，从单因素、单途径、单处杀伤向多因素、多途径、多处杀伤方向发展，从表面和脏器损伤向细胞分子损伤发展，从硬杀伤向软杀伤发展，以及造成心理创伤和心理失能等[8]。另外，新的高效能核化生武器、高强度连续作战、恶劣的自然环境，造成的睡眠剥夺、心理应急、人机协调等问题，使得指战员心理和心理应急问题更加突出。上述军事医学需求对军事药学提出了新的更高的要求，将促进军事药学学科向更深的领域拓展。
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通常所谓的学科是指有关高等学校或研究部门为培养高级专业人才而设立的教学科目，也就是我们通常所说国家教育部门颁布的《授予博士、硕士学科专业目录》中的二级学科。学科形成确立必须具有学科本身独有的概念内涵、理论原理、方法原则、范畴规范等学科要素，学科基本理论或规律、研究对象、研究内容、研究方法是学科形成的主要标志。军事药学是随着人类的战争产生、发展的，它与当时的军事、政治、文化、经济和科学技术息息相关。军事药学的发展历程大致可分为冷兵器时代、近代、现代三个阶段，但真正形成军事药学学科体系是近十几年来的事情，并且仍在发展完善当中。为此，讨论军事药学学科体系与分类具有重要价值与意义。
外军军事药学形成的标志是前德军1988年出版的《军事药学》专著一书，书中将军事药学定义为研究武装部队的医疗物资保障的科学，结合理论与实践，组织医疗物资的供应。与药学、军事医学有紧密的联系。研究领域包括医疗物资保障的组织管理、军用制药化学和技术以及军用医学技术，其研究内容涵盖丰富，尤其突出医疗物资的保障管理和卫勤指挥[9]。美军对军事药学学科没有明确的界定，但美军有关军队特需药品的研究与保障，随着频繁参与实战而获得军事医学快速发展的同时，军事药学方面的研究也达到了较高水平。从美军药品研究与保障分工来看，美军的军事药学包括军队特需药品的研究开发与管理、药材保障、药学人员管理等内容。
我国军事药学学科创建起源于军事需求，即核化生特种武器损伤防治药物和疟疾治疗药物的研究。特种武器损伤防治药物的研究，促进了药理学、药物化学、药剂学、药物分析学等学科专业的发展，也培养了一批军事药学基础理论扎实、研究方法适用、实践经验丰富的国内外知名的军事药学学科队伍，对军事药学学科体系的形成发展与完善起到了非常重要的作用。2003年，我国第一部《军事药学》专著出版，系统阐述军事药学学科的全貌，奠定了我国军事药学学科形成的理论基础，为军事药学学科的建设发展提供基本依据。依据我军《“十二五”军事医学重点建设学科专业领域指南》，于2012年原军事医学科学院和原第二军医大学自主设立了军事药学二级学科，成为军队“2110工程”三期军事药学军事重点学科建设的承建单位，同时，在博士、硕士专业目录中设置军事药学，开展研究生招生培养工作，逐步形成了具有中国特色的军事药学学科体系。
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军事药学学科的形成来源于军事实践需求，各分支学科在不同历史条件下形成，因而其研究内容有所侧重。由于各分支学科发展完善的程度具有较大差异，造成军事药学学科分类呈现多元、多维、多态和复杂性特点。就目前军事药学学科分类来看，最主要是按功能作用将学科分为军事药学科技、军事药学服务、军事药学（品）监管、军事药学教育等学科[10]。但上述军事药学划分也存在着相关学科归纳不完全，分类和组织方式缺乏严密逻辑，学科间界线模糊等诸多问题。军事药学学科分类是一个重要且基本的理论问题，学术界对军事药学学科的分类划分，至今还未形成一个公认的划分框架，统一的军事药学学科分类标准尚未形成。但是，作为一个基本科学理论问题，进行努力探索并提出科学合理的解决方案，是军事药学学科建设的重要认知目标和必经的发展完善阶段。在学科分类划分研究过程中，必须秉承系统整体、发展规律、科学合理、客观标准的原则，从本学科长远发展和建设完善的角度，尽量避免主观因素对分类划分的影响，切实将军事药学学科体系分类做到尽可能科学合理。
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军事药学是集研发、服务、监督、教育等一体的实践活动学科群，也是包含科学技术、工程制造、管理监督等要素，具有知识属性的复杂学科体系。从军事药学学科分支的地位、作用、功能、目标及其相互关系的角度进行军事药学学科特征的研究分析、归纳总结，是科学合理进行军事药学学科分类的重要思路。从军事药学研究对象、保障群体、作战能力与健康维护需求，以及军事特殊环境下特殊的技战术指标和保障方式角度，军事药学明显区别于一般药学学科。“全寿命、全维度、全过程”的军事药学保障方式，以及“生物-心理-社会医学”的综合医学模式的提出，对一般药学提出了挑战，也使得军事药学具有鲜明的军事特征。
军事药学是一门包罗自然、社会与人文科学的综合性学科。在这一综合性学科下，又包括许多不同的层级并形成体系。既有发现和认识药物现象、探索药物作用规律的基础药学学科，也有指导临床药物使用的临床药学学科；既有实现特殊环境下满足药品需求的特种药学，也有针对健康维护与战斗力提升的药学保健；既有保障药品质量的药事管理学科，也有保证药物供应的军队材供应管理学。作为药学的分支学科，军事药学也包罗了科学、技术、工程与管理等学科。同时，军事药学还涉及到社会科学、自然科学、心理科学、系统科学、文化科学、数学、军事等学科领域。军事药学学科所具有的系统化特征，其学科分类必须按照多维度进行科学分类，只有按照系统化的思想进行归纳总结，才能使得军事药学学科分类科学、客观、合理，否则分类划分易产生以偏概全的问题。为此，我们将军事药学学科分为军事药学基础学科、军事药学技术学科、军事药学工程学科、军事药学管理学科四大学科类别。
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军事药学基础学科是依托一般药学基础理论，解决战伤与军事特殊环境药物最基本的实际问题，探索药物在机体活动和发挥作用的基本规律。军事药学基础学科，是药学科学在军事实践过程中为了解决和满足军事特殊需求问题而出现的学科。与药学科学的研究内容相比，军事药学相对较窄，与特定战伤或疾病防治药物紧密相关，往往是对战伤或特殊疾病防治药物的规律、机制进行深入分析研究。如特种武器、特殊军事环境条件下创伤防治药物的作用机制研究，这些领域一般药学涉及较少。军事药学基础学科的理论方法来源于药学科学，其为军事药学提供理论知识的同时，反过来丰富了一般药学的知识，拓展了药学的认识领域。从系统结构的角度，军事药学基础学科包括军事药物化学、军事药理学、军事药剂学、军事生药学、军事生化药学、军事药物分析学等。
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军事药学技术学科以其应用性为学科基本特征，与军事药学基础学科区别明显。军事药学技术学科强调的是技术应用，特别是药学技术在战伤（病）救治上的军事应用，应用的针对性、目的性比较强，药学技术能否达到军事上的效果最为关键。与药学技术学相比军事药学技术学科，与特定战伤或疾病防治药物使用、应用紧密相关，往往是对战伤或特殊疾病防治药物的应用技术进行深入分析研究。如特种武器、特殊军事环境条件下治疗手段、临床规律、使用需求，以及药械合一的药学技术在军事需求中的实际应用等。军事药学技术学科包括军事药物流行病学、军事药物治疗学、军事药学工效学、军事药学信息学、军事药学心理学、军事药物装备学等。
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军事药学工程学科具有目的明确、组织集成、层次多样、关系交错等特点，是在特定的药材保障目的驱动下，采用工程化思维方式，在军队药材保障历史实践活动中而形成。军事药学工程学科是在军事药学基础学科和军事药学技术学科的基础上建立起来，以特定的保障对象、领域为目标，解决一定范围药材保障问题而发展形成的一门学科。军事药学工程学科主要包括特种武器损伤药学（“三防”损伤药学、新概念武器损伤药学）、军兵种药学（陆军军事药学、海军军事药学、空军军事药学、火箭军军事药学）、军事特殊自然环境药学、军事作业环境药学等。
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军事药学管理学科是系统研究军事药学管理活动的基本规律和一般方法的科学。是基于现有药材保障条件下，对军事药学资源如何进行合理优化配置，如何提高军队药材保障效率与能力的科学。随着聚焦后勤、精确后勤、即时后勤及感知与响应后勤保障理论的变革[11]，军人健康管理、军事“三位一体”教育体系逐渐形成，军事药学管理学科迎来前所未有的挑战，进入一个新的蓬勃发展时期，对科学管理要求凸显。军事药学管理学科主要包括军队药材供应管理学、军事药学情报学、军队医院药事管理学、军事药学史、军事药学教育学、军队药品监管科学等。
学科分类是一个相当漫长的过程，军事药学学科作为一个系统，将处于不断发展和完善的过程当中。与其他学科相比，军事药学学科建设时间更加短暂。从系统结构的角度划分的军事药学学科体系研究也需进一步深入。无论是从思维方式、目的作用、军事需求等角度进行符合逻辑的军事药学学科体系划分，还是从教学、科研、临床等领域进行符合认知的军事药学学科体系分类，都仅仅是一种学科分类的认知方向，从整体上讲，军事药学学科体系分类还处于相对局部认识的阶段。系统结构化分析法是一种着眼于关系主体的认知思维方法，能够从全局的角度，对学科分类进行深刻全面的认识。采用任何一种军事药学学科分类方法，对于一个复杂的学科体系而言，总是会存在着一定的瑕疵。因此，加强军事药学学科体系的研究，探索更加科学合理的学科体系分类，将有助于提高军事药学学科整体认知水平、加快军事药学学科体系的发展完善。
Disciplinary system and classification of military pharmacy
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摘要:
目的 探讨军事药学学科体系与分类。 方法 运用系统分析和系统结构化法，在对军事药学的学科定位、分类现状、分类思路和分类方法进行全面梳理、分析、归纳的基础上，描述军事药学学科体系。 结果 军事药学学科体系可划分为军事药学基础学科、军事药学技术学科、军事药学工程学科、军事药学管理学科四大类及若干小类。 结论 加强军事药学学科体系的研究将完善学科体系分类，有助于提高军事药学学科整体认知水平、推进军事药学学科的发展。 Abstract:Objective To discuss the system and classification of military pharmacy disciplines. Methods Based on the analysis and induction of the military pharmacy subject positioning, classification status, classification ideas and classification methods, the military pharmacy subject system is described with system analysis and system structured approach. Results The military pharmacy disciplinary system may be divided into four major categories: military pharmacy science, military pharmacy technology, military pharmacy engineering, and military pharmacy management, and several sub-categories. Conclusion Strengthening the research of military pharmacy disciplinary system will improve the disciplinary system classification, which will help improve the overall cognitive level of military pharmacy discipline and accelerate the development of military pharmacy disciplinary system. -
Key words:
- pharmacy /
- military medicine /
- subject system /
- discipline classification
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骨质疏松症(osteoporosis, OP)是以骨微细结构破坏和骨量减少为特征的全身性骨代谢疾病，可导致骨脆性和骨折风险增加，多见于老年人。衰老是致骨质疏松的一个重要因素，随着机体的衰老，骨骼中过多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)抑制成骨细胞的增殖、分化和成熟，抑制成骨细胞分泌骨基质及骨基质的矿化，同时促进破骨细胞骨吸收，导致骨质疏松的发生。2018年国家卫生健康委员会发布OP流行病学调查结果显示，我国65岁以上人群OP患病率达32.0%，其中，男性为10.7%，女性为51.6%[1]。四烯甲萘醌(menatetrenone, MK4)在临床上常单独或协同用于防治老年性骨质疏松症，疗效显著[2-3]，是我国现版《原发性骨质疏松症诊疗指南》和《骨质疏松症中西医结合诊疗指南》的推荐药物[1-2]。药理研究发现，MK4能促进成骨增殖、分化和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性[3-4]。MK4能通过调节氧化应激相关基因和蛋白，在成骨细胞骨形成中发挥保护作用[5]，且能阻止成骨细胞凋亡[6]。过氧化氢(H2O2)是ROS在体内存在的主要形式，会穿透成骨细胞造成细胞损伤，本研究拟探讨MK4对H2O2刺激成骨细胞氧化损伤的保护作用和调控机制，阐明MK4抗老年性骨质疏松的作用机制。
1. 材料
成骨细胞系MC3T3-El（中国科学院上海生命科学研究细胞资源中心）；特级胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、双抗(青霉素和链霉素混合液)和PBS缓冲液(pH=7.2)均购自美国GIBCO公司；噻唑蓝（MTT）、MK4（Sigma公司）。过氧化氢(H2O2，比利时Acros Organics公司）；丙二醛(MDA)试剂盒、谷胱甘肽(GSH)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、JC-1线粒体膜电势(MMP)试剂盒和活性氧(ROS)试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、核酸提取试剂盒、反转录试剂盒和扩增试剂盒（均为Thermo Fisher公司产品）；叉头框蛋白(FoxO1和FoxO3)、β细胞淋巴瘤/白血病基因2(Bcl2)和凋亡基因(Bax)等引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
2. 方法
2.1 MTT法检测成骨细胞活力
复苏MC3T3-El小鼠成骨细胞系，置于5 ml含10% FBS的DMEM培养基中，放入37 ℃、5% CO2培养箱。以2×104/ml浓度的成骨细胞接种于96孔培养板中培养24 h后，分别采用0、10、20、50和100 μmol/L(n =10)的H2O2处理，培养4、12、24 h后，采用碧云天MTT试剂盒测定细胞活力。
以2×104/ml浓度的成骨细胞接种于96孔培养板中培养24 h后，并按空白、氧化应激模型、药物剂量分组：①对照组，②选择合适浓度H2O2组，③H2O2 +10 μmol/L MK4组，④H2O2 +1 μmol/L MK4组，⑤H2O2 + 0.1 μmol/L MK4组。加入药物培养24 h，采用MTT法检测细胞增殖活性。
2.2 成骨细胞ALP活性
以2×104/ml浓度的成骨细胞接种于96孔培养板中培养24 h，按照方法“2.1”项下设置各实验组，连续培养6 d，每3 d换液1次，采用硝基苯酚磷酸二钠法检测ALP活性。给药6 d后，弃培养液，PBS洗3次，依次加入100 μl二乙醇胺（50 mmol/L），50 μl的对硝基苯酚磷酸二钠（2.5 mmol/L），在37 ℃孵育30 min，再加入50 μl的0.3 mol/L氢氧化钠溶液终止反应，置405nm处，测吸光度值(A)。以不同浓度的对硝基苯酚溶液绘制标准曲线，ALP活性由每孔释放的对硝基苯酚的μmol数表示。
2.3 成骨细胞骨结节面积
以5×104/ml浓度的成骨细胞将MC3T3-El细胞接种于12孔板内，放入37 ℃，5% CO2培养箱，12 h后换骨结节诱导培养基(0.1%牛血清白蛋白、10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μg/ml抗坏血酸以及10%胎牛血清的DMEM培养基)培养24 h，按照方法“2.1”项下设置各实验组，每3 d换液1次，连续培养14 d，采用0.1%茜素红-Tris-Hcl染液(pH 8.3)染色，37 ℃下染色30 min，采用倒置相差显微镜(Leica DMI 3000)观察，并随机拍照10张，用image-Pro Plus (IPP 6.0)分析骨结节面积。
2.4 细胞线粒体膜电势、ROS和氧化应激酶MDA、GSH、SOD测定
以2×105/ml细胞浓度铺6孔板，培养24 h后，按照方法“2.1”项下设置各实验组，干预24 h后，用荧光酶标仪法分别测定JC-1单体和复合物的荧光，DCFH-DA探针法测活性氧水平，ELISA法测定GSH、SOD和MDA水平。
2.5 细胞凋亡检测
以1×106/ml细胞浓度铺6孔板，培养12 h后，按照方法“2.1”项下设置各实验组，干预24 h后，依据Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书，采用流式细胞仪法检测。
2.6 RT-PCR
以1×106/ml细胞浓度铺6孔板，培养12 h后，按照方法“2.1”项下设置各实验组，干预24 h后，依据试剂盒说明书进行提取总RNA和反转录后，分别对GAPDH、SOD2、FoxO1、FoxO3、Bcl-2和bax进行RT-PCR扩增，引物序列见表1，PCR反应条件：采用预变性95 ℃、10 min，变性95 ℃、45 s，退火60 ℃、45 s，延伸72 ℃、50 s，循环40次，总反应体系为10 μl。
表 1 小鼠引物序列基因 上游引物 下游引物 SOD2 TCCCAGACCTGCCTTACGA TCGGTGGCGTTGAGATTG FoxO1 GTACGCCGACCTCATCACCAAG GCACGCTCTTCACCATCCACTC FoxO3 TGCTAAGCAGGCCTCATCTCAA AAGCTGTAAACGGATCACTGTC Bcl-2 AGGAGCAGGTGCCTACAAGA GCATTTTCCCACCACTGTCG bax CATCCAGGATCGAGCAGA GCCTTGAGCACCAGTTTG GAPDH TGAACGGGAAGCTAAGG TCCACCACCCTGTTGCTGGA 2.7 统计学分析
每组实验重复3次。采用SPSS软件经ANOVA方差分析检验，差异有统计学意义（α=0.05），再采用Student's t test检验进行两组比较，以P<0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1 H2O2处理MC3T3-El成骨细胞
MC3T3-E1经0～100 μmol/L H2O2分别处理4、12、24 h，结果发现0～100 μmol/L H2O2处理4 h对细胞活力均无显著性影响(P>0.05)，处理12 h后，在50和100 μmol/L H2O2下的细胞活力显著降低，分别降低19.4%和33.4%。H2O2干预24 h后，在20、50、100 μmol/L均具有显著性差异，分别降低13.2%，47.4%和57.9%(表2)。故后续实验选择20 μmol/L处理24 h。
表 2 H2O2处理的时间与浓度对成骨细胞活力的影响处理时间(t/h) 对照组 H2O2浓度(μmol/L) 10 20 50 100 4 0.22±0.04 0.23±0.03 0.22±0.04 0.21±0.05 0.20±0.04 12 0.31±0.05 0.33±0.04 0.30±0.04 0.27±0.02* 0.22±0.03* 24 0.38±0.03 0.39±0.03 0.34±0.02* 0.20±0.03** 0.16±0.04** *P<0.05，**P<0.01，与对照组比较。 3.2 MK4对H2O2损伤成骨细胞增殖、ALP活性和骨结节形成的影响
MC3T3-E1经20 μmol/L H2O2处理24 h后，结果显示，显著抑制了成骨细胞的细胞活力(P<0.05)，ALP活性(P<0.05)和骨结节形成面积(P<0.05)，与空白组比较，分别降低13%、16%和85%，见表3和图1。与模型组比较，MK4在1～10 μmol/L可促进H2O2损伤成骨细胞增殖(P<0.05)。同样，MK4在1～10 μmol/L能显著改善ALP活性(P<0.05)和提高骨结节形成面积(P<0.05)，分别增加50.7%和44.5% (表3和图1)。
图 1 MK4对H2O2损伤成骨细胞骨结节的影响(×200)A. 对照组; B. H2O2组; C−E. H2O2+10、1、0.1 μmol/L MK4组; F. 骨结节面积表 3 MK4对H2O2损伤成骨细胞的影响组别 MTT(%对照) ALP(%对照) MPP(%对照) 活性氧(%对照) MDA(μmol/g) 细胞凋亡率(%) 对照组 1.00±0.01* 1.00±0.02* 1.00±0.02* 1.00±0.01* 27.2±4.3** 2.3±0.3* H2O2组 0.87±0.02 0.84±0.03 0.78±0.05 1.13±0.02 51.0±3.7 7.3±0.3 H2O2+MK4(10 μmol/L)组 1.03±0.04* 0.99±0.03* 1.05±0.07* 1.02±0.02* 27.3±3.1** 1.8±0.2* H2O2+MK4(1 μmol/L)组 0.96±0.03 0.87±0.04 0.88±0.21 1.06±0.05 44.8±2.0 2.9±0.3* H2O2+MK4(0.1 μmol/L)组 0.85±0.03 0.80±0.03 0.82±0.09 1.09±0.05 51.6±0.3 5.7±0.4 *P<0.05，**P<0.01，与H2O2组比较。 3.3 MK4对H2O2损伤成骨细胞线粒体膜电势、活性氧和抗氧化酶的影响
MC3T3-E1成骨细胞经20 μmol/L H2O2处理24 h后，结果发现显著降低成骨细胞膜电势和增高活性氧含量(P<0.05)。与模型组比较，MK4在10 μmol/L可促进H2O2损伤成骨细胞膜电势升高和降低活性氧含量(P<0.05)。与空白组比较，20 μmol/L H2O2能显著降低FoxO1, FoxO3和SOD2的mRNA表达(P<0.05)。与H2O2组比较，给予10 μmol/L MK4后，FoxO1, FoxO3和SOD2的mRNA表达均显著增高(P<0.01)。
3.4 MK4对H2O2损伤成骨细胞凋亡的影响
在通道1和通道2观察单个细胞分布区域，选定99.9%的细胞区域用于后续分析，在通道3和通道4观察凋亡细胞分布，Q4为正常细胞，Q1为坏死细胞；Q2为晚期凋亡细胞，Q3为早期凋亡细胞。与对照组比较，20 μmol/L H2O2处理24 h后，细胞的凋亡率显著增高(P<0.05)。经0.1～10 μmol/L浓度MK4干预24 h后发现，1～10 μmol/L浓度MK4能显著降低细胞凋亡率(P<0.05)，与对照组相近，见表3和图2。与空白组比较，20 μmol/LH2O2能显著降低Bcl-2的mRNA表达(P<0.001)，bax表达无显著差异，给予10 μmol/L MK4后，Bcl-2和bax的mRNA表达均显著增高(P<0.01)，见图3。H2O2组的bax/Bcl-2比值为对照组的22.5倍，而MK4处理后降低至对照组的7.6倍。
图 2 MK4对H2O2损伤成骨细胞凋亡的影响A.对照组单个细胞选择范围; B.对照组; C. H2O2组; D−F. H2O2+10、1、0.1 μmol/L MK4组4. 结论与讨论
骨代谢中，机体通过调节FoxOs转录因子的活性，产生抗氧化物酶，对抗氧化应激对骨骼的损伤，包括FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6等，其中，FoxO1和FoxO3是调节成骨细胞氧化还原平衡和成骨功能的主要分子[7]。活性氧可激活FoxO1的转录，调节线粒体抗氧化酶Mn-SOD的活性[8]。随着活性氧的升高，FoxO3下调，成骨细胞分化受损，抑制骨形成作用[9]。本研究发现，MK4对H2O2引起的氧化应激具有显著的改善作用，降低活性氧和脂质氧化产物MDA水平，上调转录因子FoxO1、FoxO3和抗氧化酶SOD的mRNA表达。
Bcl-2蛋白可减少氧化应激水平，而bax基因可与Bcl-2形成异源二聚体，抑制Bcl-2的作用，进而诱导细胞凋亡。MK4可上调Bcl-2/bax比值，抑制了成骨细胞凋亡[10]。本研究发现，H2O2能显著提高成骨细胞凋亡率，同时增加bax的表达，降低Bcl-2蛋白表达。MK4处理组对成骨细胞凋亡的拮抗作用明显，随着剂量浓度增加而增加。MK4在在氧化应激状态下，可显著上调Bcl-2，下调bax的基因表达，bax/Bcl-2比值显著降低，抑制了成骨细胞凋亡。
FoxOs激活促进Bcl-2相关凋亡调节蛋白(Bim)转录，Bim是线粒体凋亡通路的核心调控者，引起成骨细胞线粒体膜电位降低[10]。线粒体跨膜电位降低说明线粒体膜通透性转运孔(MPTP)过度开放。若MPTP过度开放，易引起呼吸链解偶联，线粒体基质渗透压增高，使得促凋亡活性物质从线粒体释放入细胞基质，导致细胞凋亡。MK4显著改善了H2O2刺激的成骨细胞线粒体膜电势降低，表明MK4对H2O2刺激成骨细胞的氧化损伤具有保护作用。
综上所述，MK4能显著抑制H2O2刺激的成骨细胞氧化损伤，机制与FoxO转录因子相关。同时，MK4对H2O2引起的成骨细胞凋亡具有拮抗作用，其机制为上调Bcl-2和下调bax的基因表达。
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