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啮齿类动物暴露于各种环境和实验等应激刺激条件下，产生许多行为和生理性应激反应[1-2]。应激刺激可致啮齿类动物痛阈升高，痛觉敏感性降低而诱发镇痛，即应激镇痛。测定痛阈的方法有压尾法、甩尾法、热板法和压脚法等[1]。根据应激刺激的特点（如应激源，持续时间，强度和时间模式），镇痛可能由内源性阿片系统或其他非阿片的激素和神经生化机制调解[2-3]。
旋转刺激可诱发啮齿类动物发生晕动病症状，例如异食癖，条件性厌食症，自发活动减少和激素水平变化等[4-6]。肾上腺酮等激素水平的升高，提示某些前庭刺激，如旋转亦可诱发啮齿类动物应激镇痛反应，引起应激镇痛的旋转亦是诱发啮齿类动物晕动病的有效前庭刺激条件。可见，以角加速度为主的平面旋转刺激，可诱发小鼠晕动病和应激镇痛反应。因此，研究旋转诱发的晕动病与应激镇痛之间功能联系的机制非常有意义[7-8]。二者都是通过相同的前庭刺激引起的，反应程度都依赖于应激刺激强度、类型和持续时间等。而且，重复的旋转刺激易致小鼠对镇痛耐受和晕动病的习服。
本实验以热板潜伏期为指标，在以角加速度为主的水平旋转刺激下，观察了化学迷路切除对小鼠旋转诱发的应激镇痛和吗啡镇痛的影响。
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吗啡原料（青海制药厂）；纳洛酮原料（北京四环药厂）；对氨基苯胂酸（Sigma公司）。
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健康昆明种小鼠，雌性，体重：18～22 g。小鼠为清洁级，实验动物质量合格证号：SCXK（沪）2002－0002，由复旦大学医学院实验动物部提供。
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小鼠旋转仪：由控制装置和旋转装置两部分组成。控制装置可调节并显示旋转装置的旋转速度、旋转时间和变速周期。本实验选择转速250 r/min，旋转时间1 min，变速周期为每旋转15 s停止5 s。
旋转装置位于控制装置上方，为一可旋转的方形有机玻璃板（21 cm×21 cm×0.2 cm），旋转转盘的对角线的四角排列着4个可以容纳小鼠的三角形有机玻璃小盒，小盒中心距离旋转轴心均为10 cm。在250 r/min转速下，旋转时小鼠头朝向离心端，旋转半径为10 cm。
热板仪：由电热恒温水浴锅和热板组成。电热恒温水浴锅可程控设置，并显示水浴温度，温度控制精确到0.1 ℃。热板为紫铜板焊接而成的25 cm×14 cm×7 cm（长×宽×高）的槽形体，底部嵌入水浴水面下5 cm，以保证热板受热充分而均匀，由于浮力使热板槽卡紧在水浴锅中。
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应用小鼠旋转仪和热板仪。热板的水浴指示温度为（55.0±0.5）℃。实验时室温维持在23～25 ℃，环境湿度和照明度等应控制相对恒定，减小系统误差。实验时旋转刺激前先测定2次小鼠热板反应时间（即放入热板至首次舔后足时间）取其平均值作为基础潜伏期，挑选基础潜伏期在10～20 s的小鼠作为实验动物，2次测定间隔至少5 min。旋转后热板反应时间在30～50 s较合适。如舔后足潜伏期超过60 s，应中止热板刺激，以免烫伤足底。
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取雌性小鼠32只，随机分为4组，每组8只：①吗啡（5 mg/kg，sc）+生理盐水（10 ml/kg，ip）；②吗啡（5 mg/kg，sc）+纳洛酮（4 mg/kg，ip）；③生理盐水（10 ml/kg，ip）+旋转刺激；④纳洛酮（4 mg/kg，ip）+旋转刺激。①②组小鼠给药15 min后即刻测定热板潜伏期；③④组小鼠给药15 min后开始旋转，旋转结束后即刻测定热板潜伏期。
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取雌性小鼠20只，随机分为2组，每组10只，即生理盐水对照组（10 ml/kg，sc）和吗啡组（5 mg/kg，sc）。每天给药2次（上午9时，下午4时），连续给药7 d。d0、d1、d3、d5和d7下午给药15 min后分别测定小鼠热板潜伏期。首次给药前（d0）和末次给药后（d7）15 min分别测定旋转后小鼠热板潜伏期。
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取雌性小鼠16只，随机分为前庭损伤组（对氨基苯胂酸钠）和假损伤组（生理盐水），每组8只。取0.3 mol/L的NaHCO3溶液加至100 mg/ml的对氨基苯胂酸溶液中，调节pH中性即可形成对氨基苯胂酸钠溶液。动物经戊巴比妥钠麻醉后，注射针穿过鼓膜向鼓室内注射对氨基苯胂酸钠溶液或生理盐水0.04～0.06 ml，注射完毕后用火棉胶紧紧塞住以防药液渗漏。监测动物直到麻醉苏醒可放入饲养笼恢复3～5 d。
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将小鼠置于去芯的50 ml注射器外管中使其呈仰卧位。正常小鼠能感受体位颠倒，并且在数秒内翻正颠倒的体位；前庭损伤小鼠则难以感受颠倒的体位而不能翻转或体位翻正时间延长。实验中观察并记录小鼠翻正反射恢复时间。
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将小鼠置于20 cm × 40 cm的盛水容器中，温度控制在(23 ± 2)℃，观察小鼠在60 s内头部露出水平面游泳的时间。正常动物可在60 s内一直保持头部露出水面游泳，而前庭损伤者头部常难以浮出水面。
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前庭功能评价后，先测定2次小鼠热板反应时间取其平均值作为基础潜伏期。然后，测定前庭损伤和假损伤小鼠旋转后热板潜伏期。
最后，观察迷路切除对吗啡镇痛作用的影响。给予吗啡（5 mg/kg，sc）15 min后测定前庭损伤和假损伤小鼠热板潜伏期。
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数据以均数±标准差(
$ \bar{x}\pm s $ )表示。采用SPSS 13.0统计软件进行多元方差分析（MANOVA）和单因素方差分析（LSD法）、t检验，α=0.05视为检验水准。 -
同时注射吗啡和纳洛酮15 min后，小鼠热板潜伏期显著低于生理盐水对照组（P<0.01），纳洛酮显著降低了吗啡组小鼠热板潜伏期。旋转刺激后，纳洛酮组小鼠热板潜伏期与生理盐水组比较无统计学意义（P>0.05），结果见图1。
图 1 纳洛酮对吗啡镇痛和旋转诱发应激镇痛的影响（n=8）
本实验结果表明，阿片受体拮抗剂纳洛酮可拮抗吗啡的镇痛作用，但不能拮抗旋转诱发的应激镇痛作用，提示旋转诱发的热板潜伏期延长与吗啡镇痛作用机制可能不同，或旋转诱发的小鼠热板潜伏期延长是可能通过非阿片系统起作用的。
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图2所示，吗啡组小鼠随给药天数增加，热板潜伏期逐渐缩短。d1、d3和d5吗啡组小鼠热板潜伏期显著高于生理盐水组（P<0.01）；d7末次给药后2组小鼠热板潜伏期无统计学差异（P>0.05）。可见，吗啡组小鼠于d7已形成吗啡耐受。
图 2 吗啡镇痛作用和耐受形成(n=10)
图3所示，给药前（d0）和末次给药后（d7），吗啡组和生理盐水组小鼠旋转后热板潜伏期均无统计学差异（P>0.05）。结果提示，吗啡镇痛和旋转诱发的应激镇痛无交叉耐受性。
图 3 旋转刺激对吗啡耐受小鼠热板潜伏期的影响(n=10)
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接触翻正反射试验中，给予对氨基苯胂酸溶液组小鼠在注射器中翻正所需时间显著高于生理盐水组（P<0.01）。游泳试验中，给予生理盐水组小鼠在60 s内一直保持头部露出水面游泳，而给予对氨基苯胂酸组小鼠身体在水中螺旋翻滚，头部难以浮出水面，两组小鼠60 s内头部露出水面游泳时间的差别具有统计学意义（P< 0.01），结果见图4。
图 4 小鼠前庭功能评价(n=8)
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旋转刺激后，假损伤组小鼠自发活动减少而旋转行为增加，而前庭损伤组小鼠自发活动在旋转前后无明显变化。从图5显示，旋转前假损伤组和前庭损伤组小鼠基础潜伏期无统计学意义（P>0.05）；而旋转后前庭损伤组小鼠热板潜伏期显著降低（P<0.01），其数值几乎接近旋转前的基础潜伏期水平（旋转前12.8 s，旋转后13.9 s），而假损伤组小鼠旋转后热板潜伏期为38.3 s（旋转前12.5 s）。结果提示，化学迷路切除可能完全阻滞了旋转诱发的小鼠应激镇痛作用。
图 5 化学迷路切除对小鼠旋转后热板潜伏期的影响（n=8）
注射吗啡15 min后，前庭假损伤组和前庭损伤组小鼠热板潜伏期无统计学意义（P>0.05，图6）。结果提示，化学迷路切除对小鼠吗啡镇痛作用无明显影响。
图 6 化学迷路切除对吗啡镇痛作用的影响(n=8)
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应激是机体在受到各种强烈因素（即应激原）剌激时出现的以交感神经兴奋和垂体-肾上腺皮质分泌增多为主的一系列神经内分泌反应，并由此而引起的各种功能和代谢的改变。一定强度的任何躯体的或情绪的剌激，都可以成为应激原，如创伤、缺氧、疼痛等。啮齿类动物如大鼠或小鼠在电击足底，冷水游泳，固定，掐尾巴，离子辐射，或离心旋转等应激刺激下，痛觉敏感性均减弱，这一现象被称为“应激镇痛”[1, 6-7]。
阿片受体拮抗剂纳洛酮可拮抗吗啡对小鼠的镇痛作用，使小鼠热板潜伏期显著下降。可见，吗啡镇痛是通过阿片系统介导的。而旋转刺激诱发的痛阈上升不能被纳洛酮阻断，即旋转后纳洛酮和生理盐水对照组小鼠热板潜伏期间无显著差异。结果提示，旋转刺激诱发的应激镇痛可能是非阿片系统介导的。此外，旋转刺激对吗啡耐受小鼠应激镇痛的影响实验结果也显示，吗啡耐受小鼠和生理盐水对照小鼠旋转刺激后的热板潜伏期无显著差异，表明吗啡镇痛和旋转诱发的应激镇痛无交叉耐受性，证实旋转诱发的应激镇痛是非阿片系统介导的。因此，旋转诱发的应激镇痛与吗啡镇痛的作用机制可能不同。
诱发晕动病的旋转等前庭刺激条件也可以诱发小鼠应激镇痛，提示旋转刺激诱发的应激镇痛和晕动病效应可能存在共同的中枢机制。前庭器官在晕动病的发生中起着重要作用[12-13]。本实验中小鼠旋转后热板潜伏期显著高于旋转前的热板潜伏期，提示该前庭刺激诱发了应激镇痛，前庭器官在旋转诱发的应激镇痛中也起重要作用。
本实验进一步探讨了前庭器官在小鼠旋转诱发的应激镇痛中的作用。采用内耳注射对氨基苯胂酸溶液对小鼠施行化学迷路切除术[12-13]。游泳行为和翻正反射评估的是半规管和耳石器功能，是能够全面评价前庭功能的两个重要参数。评价小鼠前庭功能的小鼠接触翻正反射和游泳试验结果显示，对氨基苯胂酸组小鼠接触翻正反射时间显著高于生理盐水对照组，而头部露出水面游泳时间显著低于生理盐水对照组，提示对氨基苯胂酸成功损伤小鼠前庭功能，化学迷路切除术成功。
化学迷路切除小鼠旋转后热板潜伏期显著降低，且与旋转前热板潜伏期无明显差异；而正常对照小鼠旋转后热板潜伏期显著高于旋转前，表明化学迷路切除可能完全抑制或阻滞了旋转诱发的应激镇痛。另外，小鼠化学迷路切除与否，对吗啡的镇痛作用无影响，进一步提示旋转诱发的应激镇痛与吗啡镇痛作用机制可能不同，前庭器官在旋转诱发的应激镇痛中作用明显。
总之，动物行为学实验表明，前庭器官在旋转诱发的应激镇痛中起重要作用，而前庭系统究竟如何调节旋转诱发的应激镇痛有待进一步的验证和研究。
Effects of chemical labyrinthectomy on stress analgesia induced by rotation in mice
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摘要:
目的 探讨前庭器官在旋转诱发的小鼠应激镇痛中的作用。 方法 雌性小鼠随机分为吗啡组和旋转组，每组小鼠腹腔注射纳洛酮或生理盐水15 min后，观察给予吗啡或旋转（转速250 r/min，时间1 min，每旋转15 s暂停5 s）刺激后的热板潜伏期。另取小鼠连续7 d皮下注射吗啡形成耐受后，观察吗啡耐受小鼠旋转后的热板潜伏期。最后，内耳注射对氨基苯胂酸损伤小鼠前庭器官，观察化学迷路切除小鼠旋转后的热板潜伏期。 结果 与生理盐水组比较，纳洛酮组小鼠旋转后热板潜伏期无明显变化（P>0.05），皮下注射吗啡后热板潜伏期显著下降（P<0.05）。吗啡耐受小鼠旋转后热板潜伏期与生理盐水组比较无明显变化（P>0.05）。内耳注射对氨基苯胂酸后，小鼠接触翻正反射恢复时间显著增加、游泳能力显著下降（P<0.05），且化学迷路切除小鼠旋转后热板潜伏期显著缩短（P<0.05）。 结论 化学迷路切除完全阻滞了旋转诱发的小鼠应激镇痛。前庭器官在旋转诱发的应激镇痛中起重要作用，且该应激镇痛可能由非阿片系统介导。 Abstract:Objective To investigate the role of vestibular organs on stress analgesia induced by rotation in mice. Methods Female mice were randomly divided into morphine group and rotation group. After 15 minutes of intraperitoneal injection of naloxone or normal saline, the hot plate latency of mice in each group was observed following morphine injection or rotation (250 r/min, 15 s on with 5 s off). After subcutaneous injecting morphine for 7 consecutive days, tolerance was formed and the hot plate latency in morphine-tolerant mice after rotation was observed. P-aminophenylarsonic acid was injected into the inner ear to damage the vestibular organs of the mice and the hot plate latency was observed in chemically labyrinthectomy mice. Results Compared with the normal saline group, the hot plate latency of mice in the naloxone group did not change significantly after rotation (P>0.05), and the hot plate latency decreased significantly after subcutaneous injection of morphine (P<0.05). The morphine-tolerant mice had no significant change in the hot plate latency after rotation compared with the normal saline group (P>0.05). After injection of p-aminophenylarsonic acid into the inner ear, the recovery time of the righting reflex in mice was significantly increased, and the swimming ability was significantly reduced (P<0.05), and the hot plate latency of mice with chemical labyrinthectomy was significantly shortened after rotation (P<0.05). Conclusion Chemical labyrinthectomy completely blocked the rotation-induced stress analgesia in mice. Vestibular organs play an important role in rotation-induced stress analgesia, and this stress analgesia may be mediated by a non-opioid system. -
Key words:
- rotation /
- morphine /
- stress-induced analgesia /
- vestibular organs
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近年来，随着肿瘤、器官移植和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)等导致的免疫功能低下人群的增加，侵袭性真菌感染（IFIs）的发病率和病死率逐年上升[1-2]。念珠菌、隐球菌和曲霉菌是IFIs最主要的致病菌，并且造成的病死率超过90%[3]。在念珠菌属中，白念珠菌（Candida. albicans）是院内血液感染最常见的致病菌原体，其在重症监护病房（ICU）患者中致病率超过17%，病死率高达40%[4-5]。临床上治疗IFIs的抗真菌药物主要包括：多烯类（两性霉素B）、核酸类（5-氟胞嘧啶）、唑类（氟康唑）和棘白菌素类（卡泊芬净）药物（图1）[6-7]。然而，由于临床上出现抗真菌药物严重的耐药性和毒副作用，IFIs的治疗效果相当有限。因此，迫切需要研发全新机制的抗真菌药物。
组蛋白乙酰化修饰（包括组蛋白乙酰化和去乙酰化）是表观遗传学研究的重要组成部分。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）将组蛋白和其他蛋白上的赖氨酸末端乙酰基去除，对染色体重塑和基因的表达起着重要作用[8-9]。目前HDAC抑制剂主要集中于抗肿瘤研究方向，且已有多个上市药物应用于肿瘤的治疗。据研究报道，真菌中的HDACs，如烟曲霉[10]、白念珠菌[11-12]、酿酒酵母[13]和新生隐球菌的HDACs[14-15]参与了毒力相关的过程和形态变化。因此，抑制真菌HDACs可能是治疗IFIs的有效策略。
联合药物治疗是提高临床一线药物疗效并克服真菌耐药性的有效策略之一。真菌的耐药性涉及转录调节，其中染色体重塑和组蛋白修饰起主要作用。HDACs调节的组蛋白修饰在应激信号通路中起着至关重要的作用，这可能与真菌对各种环境（包括药物）的应激反应有关[16]。此外，已有研究报道，HDAC抑制剂与唑类药物联用具有协同增效作用[17-18]。例如，HDAC抑制剂MGCD290与氟康唑联用具有协同抗多种临床真菌分离株的作用[19]。
基于此，本研究首先对8个市售的HDAC抑制剂（图2）进行体外协同抗真菌活性测试，筛选结果显示化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有优秀的体外协同抗耐药白念珠菌活性。后续考察其与不同唑类药物联用时对不同念珠菌属的体外协同抗真菌活性，以及对正常细胞的毒性作用，以期为抗真菌药物的研发提供依据。
1. 材料和方法
1.1 实验试剂与菌株
临床分离的6株唑类耐药白念珠菌（编号：9893，10061，10060，9173，4108和0304103），2株唑类耐药热带念珠菌（编号：5008，10086），1株光滑念珠菌（编号：9073）和1株耳道念珠菌（编号：0029）由海军军医大学附属长征医院提供。菌株活化首先从−80 ℃中挑取菌株冻存液至YEPD液体培养基活化24 h,然后取10 μl菌悬液至1 ml YEPD中，并在30 ℃、200 r/min下培养16 h后待用。HUVEC细胞来源于中国科学院上海细胞库，并在新鲜配置的DMEM完全培养基中培养。
YEPD液体培养基：取10 g酵母浸膏、20 g葡萄糖、20 g蛋白胨溶解于1 000 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，保存于4 ℃条件下备用。RPMI 1640培养基：取10 g RPMI 1640（Gibco）粉末、34.5 g吗啡啉丙磺酸、2 g NaHCO3、2.7 g NaOH溶解于1 000 ml三蒸水中，经0.22 μm的微孔滤膜过滤与灭菌后，置于4 ℃条件下保存和备用。DMEM完全培养基：按照89% DMEM基础培养基+10%胎牛血清+1%的双抗比例混匀制得，混匀后置于4 ℃条件下保存和备用。PBS缓冲液：10 × PBS 100 ml溶解于900 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，置于4 ℃条件下保存和备用。
1.2 仪器
THZ-92A气浴恒温振荡器（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、MJ-150-I霉菌培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、LW100T生物显微镜（北京测维光电技术有限公司）、HDC-15K高速离心机（上海泰坦科技股份有限公司）、C170二氧化碳培养箱（BINDER GmbH）、infinite M200多功能酶标仪（Tecan Austria GmbH）、高压蒸汽灭菌锅、无菌洁净工作台。
1.3 棋盘式微量液基稀释法
本实验参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）公布的M27-A3方案中微量液基稀释法进行。首先，收集活化好的真菌细胞，PBS洗3次后用RPMI 1640培养基制成浓度为1×103 CFU/ml的菌悬液。按照每孔100 μl接种菌悬液至无菌96孔板中，1～9列加入倍半稀释的HDAC抑制剂，A～F行加入倍半稀释的氟康唑，其中G行只加氟康唑，第10列只加化合物，第11列为不加药的阴性对照组，后将96孔板置于35 °C条件下孵育48 h。测定每孔在630 nm处的吸光度A，依据公式：抑制率（%）=（A阳性对照孔−A化合物孔）/（A阳性对照孔−A阴性对照孔）× 100%，计算各孔对应的抑制率。如果某一孔和其左边孔对应的抑制率均大于80%，则该孔对应的化合物和FLC浓度分别作为FIC化合物和FIC氟康唑，利用协同指数公式：FICI =（FIC化合物./MIC80 化合物）+（FIC氟康唑/MIC80 氟康唑），计算各化合物对应的FICI。
1.4 时间-生长曲线实验
收集活化好的白念珠菌0304103稀释在RPMI 1640培养液中，保持菌浓度为1×105 CFU/ml。取5 ml稀释的菌悬液和不同浓度的待测药物加入50 ml的离心管中, DMSO组作为空白对照组和32 μg/ml FLC作为阳性对照。随后将50 ml的离心管置于30 °C条件下振荡培养（200 r/min），在多个时间点吸取不同药物组的真菌混悬液（100 μl）于96孔板上，测量A630值并使用GraphPad Prism 7作图。
1.5 真菌细胞总HDAC酶活性测试实验
收集指数生长期的白念珠菌0304103细胞（湿重为100 mg），然后用3 mg snailase、12 μl 2-巯基乙醇和3 ml snailase反应缓冲液等新鲜配置的真菌裂解液来处理它们，以制备真菌原生质体。真菌原生质体分散在PBS（20 ml）中以获得混悬液，然后往96孔板每孔中加入100 μl的混悬液和不同浓度的化合物Rocilinostat，并在35 °C下培育12 h。接着往每个孔中加入30 μmol/L的HDAC底物，于37°C下孵育6 h。随后添加100 μl HDAC酶促终止溶液并在37°C下孵育2 h。最后，在每个孔中取出100 μl培养物添加到黑板中，用Ex=360 nm，Em=460 nm来监测荧光强度并记录下来用于计算HDAC酶的抑制率。
2. 结果
2.1 化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有协同抗真菌活性
表1列出了HDAC抑制剂单独使用或与氟康唑联合使用的体外抗真菌活性筛选结果。MIC80为抑制80%真菌细胞生长的最低药物浓度。实验结果表明，8个HDAC抑制剂单独使用对耐药白念珠菌均无直接的抗真菌活性（MIC80>64 μg/ml）；而化合物Rocilinostat（FICI=0.039）和伏立诺他（FICI=0.125）与FLC联用时均表现出良好的协同抗真菌活性。其中，化合物Rocilinostat的协同活性最佳，值得进一步研究。
表 1 单用HDAC抑制剂或者与氟康唑联用对白念珠菌0304103的体外抗真菌活性(μg/ml)抑制剂 抑制剂 氟康唑 FICI 单用 联用 单用 联用 伏立诺他 >64 4 >64 4 0.125 Rocilinostat >64 2 >64 0.5 0.039 T3516 >64 64 >64 64 2 T6016 >64 64 >64 64 2 T6421 >64 32 >64 32 1 T2157 >64 32 >64 32 1 T1726 >64 64 >64 64 2 T3358 >64 32 >64 64 1.5 注: FICI值≤ 0.5表示协同，FICI值> 4表示拮抗；0.5<FICI<4表示不相关。 2.2 Rocilinostat与氟康唑或伏立康唑联用对多种白念珠菌的抗真菌活性
为进一步考察Rocilinostat是否具广谱的抗真菌作用，挑选9株临床分离的念珠菌属菌株进行协同抗真菌活性测试。如表2所示，Rocilinostat与FLC联合使用时，对两株耐FLC的白念珠菌（C. albicans 9173，FICI=0.094; C. albicans 4108, FICI=0.5）和对FLC敏感的光滑念珠菌（C. glabrata 9073）表现出协同增效作用，而对热带念珠菌（C. tropicis）和耳道念珠菌（C. auris）没有协同抗真菌活性。当Rocilinostat与伏立康唑（VRC）联用时，对耐VRC的白念珠菌（C. albicans 10060, FICI=0.033）表现出优异的协同抗真菌活性 (表3)。
表 2 Rocilinostat与氟康唑单用或联用对多种念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 氟康唑 Rocilinostat 氟康唑 9893 >64 >64 64 64 2 10061 >64 >64 64 64 2 10060 >64 >64 64 64 2 9173 >64 >64 4 2 0.094 4108 >64 >64 32 32 0.5 10186 >64 >64 64 64 2 5008 >64 >64 64 8 1.125 9073 32 4 32 8 0.375 0029 64 32 >64 32 1 表 3 Rocilinostat与伏立康唑单用或联用对白念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 伏立康唑 Rocilinostat 伏立康唑 0304103 >64 >64 32 2 0.531 10061 >64 >64 32 0.125 0.502 10060 >64 >64 2 0.125 0.033 2.3 Rocilinostat与氟康唑联用有效抑制真菌的生长
为进一步考察化合物Rocilinostat的协同抗真菌活性，我们又开展了时间-生长曲线实验。从图3结果可以看出，高浓度的氟康唑或Rocilinostat单独使用对真菌生长无抑制作用，而Rocilinostat与不同浓度的氟康唑联用能够有效抑制真菌的生长，且呈浓度依赖趋势 (图3中抑制剂为Rocilinostat)。
2.4 Rocilinostat对真菌细胞的选择性作用
采用HUVEC（人脐静脉内皮细胞）对化合物Rocilinostat进行细胞毒性的评价。结果如表4显示，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，IC50值为52.17 μmol/L (22.60 μg/ml)，相当于其发挥协同抗耐药真菌（C. albicans 0304103）活性MIC80值的44倍，表明Rocilinostat对真菌细胞具有较强的选择性作用。此外，我们还测试了化合物Rocilinostat对真菌总HDAC酶的抑制活性，结果表明，Rocilinostat对真菌HDAC酶抑制活性（IC50=0.41 μmol/L）优于泛HDAC抑制剂伏立诺他（IC50=1.03 μmol/L）。
表 4 Rocilinostat对正常细胞的毒性和真菌总HDAC酶活性IC50 (μmol/L)化合物 HUVEC 白念珠菌（总HDAC酶） Rocilinostat 52.17 0.41 伏立诺他 — 1.03 注: “—”表示没有测试。 3. 讨论
本研究从市售的8个HDAC抑制剂中筛选出协同活性最佳的化合物Rocilinostat。进一步研究发现Rocilinostat与氟康唑联用对白念珠菌和光滑念珠菌具有协同增效作用。此外，化合物Rocilinostat与伏立康唑联用对临床分离的耐药白念珠菌株同样具有优秀的抗真菌活性。更值得关注的是，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，其对真菌细胞具有很好的选择性。因此，HDAC抑制剂Rocilinostat可以作为一种低毒、有效的唑类抗真菌药物增效剂，为抗真菌药物的发展提供了新的研究基础。
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