Establishment of in vitro biological activity evaluation system for OTULIN

NanoDrop超微量分光光度计（Thermo）、天平（Sartorius）、纯水仪（Millipore）、低温高速离心机（Eppendorf）、控温摇床（上海知楚仪器有限公司）、超声破碎仪（宁波新艺超声设备有限公司）、水浴锅（群安科学仪器有限公司）、超净台（江苏苏净集团有限公司）、垂直电泳槽（天能，VE-180）、电泳仪（天能，100-1300）、电泳槽（上海天能Tanon）、纯水仪（Millipore公司）和往复式脱色摇床（KYLIN-BELL公司）。

灭菌水、灭菌枪头、灭菌EP管、灭菌摇菌管、感受态细胞BL21、DH5α，LB培养基、Ni-NTA磁珠、酶蛋白诱导剂、蛋白酶抑制剂、β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素和咪唑。SDS/PAGE胶及电泳液（雅酶，LK309），转膜液5 × Transfer Buffer（BIO-RAD，10026938）、PVDF膜（Merck）、速溶型蛋白上样缓冲液5 × Loading buffer（雅酶，LT101S）、双色预染蛋白Marker（雅酶，WJ102）、无蛋白快速封闭液（雅酶，PS108P）、通用型抗体稀释液（雅酶，PS119L）、Alexa Fluor^® 680 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（翌圣，33218ES60，1:25 000）、Alexa Fluor^® 680 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（翌圣，33118ES60，1:25 000）和Mouse anti His-Tag mAb（爱博泰克，AE003）。OTULIN质粒、His-Ub-Ub-Flag质粒、考马斯亮蓝快速免脱色染色液（派翠，KB0016）。

根据文献方法^[15]分析OTULIN与底物蛋白Met1-diUb复合晶体结构（PDB：5OE7，2.95 Å），采用人源Met1-Ub基因序列，设计了首个人源His-Ub-Ub-Flag重组表达质粒，由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成，测序正确。His-Ub-Ub-Flag质粒序列如下所示。

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根据文献方法^[16]，采用大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞进行转化。首先，将质粒干粉溶解于40 μl ddH₂O中，充分混匀后配制成终浓度为100 ng/μl的质粒溶液。取2 μl质粒溶液加入50 μl BL21（DE3）感受态细胞中，轻轻混匀后置于冰上静置30 min。随后，将感受态细胞于42℃热激90 s，以促进质粒进入细胞内，并立即置于冰上静置。之后加入800 μl LB液体培养基，于37℃、140 r/min摇床中振荡培养1 h，以促进细胞复苏。

复苏结束后，将菌液于3 000 r/min离心2 min，弃去上清液，保留菌体沉淀，并用100 μl LB培养基重悬。由于His-Ub-Ub-Flag质粒具有卡那霉素抗性，取100 μl重悬菌液均匀涂布于含卡那霉素的LB固体培养基平板上，倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养。次日观察菌落生长情况，结果显示His-Ub-Ub-Flag质粒已成功转化至BL21（DE3）感受态细胞中，用于后续诱导表达。

上述质粒转化实验结果显示，His-Ub-Ub-Flag在Escherichia coli （E.coli）的BL21转化效率较高。挑选单克隆菌落，转至3 ml含卡那霉素的LB液体培养基，置于37℃，220 r/min，摇床上震荡过夜，并收集小摇表达后的菌落。经过对蛋白诱导条件的摸索，考察不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）,在37、18、25℃温度下的蛋白诱导条件，分别将诱导得到的蛋白，电泳上样后用考马斯亮蓝染色方法检测蛋白纯度，发现最优的蛋白诱导条件为18℃，0.2 mmol/L IPTG，220 r/min，14~16 h（图1）。

挑选His-Ub-Ub-Flag质粒的在BL21中的单克隆菌落，取2 ml小摇菌液加入到准备好的具有卡那霉素抗性的400 ml LB液体培养基，置于37℃、220 r/min摇床上振荡过夜。待大摇菌液A值测试为0.6～1之间，加入0.2 mmol/L IPTG，置于18℃下，220 r/min，摇床振荡14～16 h诱导蛋白大量表达。次日，将大摇菌液分装50 ml离心管中，4℃，4 000 r/min，离心20 min。弃上清液，将菌落沉淀置于−80℃保存。

His-Ub-Ub-Flag表达载体携带6 × His Tag，蛋白大量表达后选用Ni²⁺离子亲和层析柱进行初步纯化。在蛋白纯化实验中，使用适量的蛋白裂解缓冲液buffer A（20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH 8.0）重悬菌体，离心后弃上清液，再加入适量蛋白酶抑制剂。将菌液置于超声破碎仪，破碎超声至菌液澄清。将菌液置于4℃，13 000 r/min，离心30 min。弃上清液，在沉淀中加入活化后的Ni-NTA磁珠共孵育。离心并弃上清液后，配制不同浓度比例咪唑的Tris buffer洗脱蛋白，反复清洗沉淀4次，洗脱掉不结合的杂蛋白，浓缩后收集目标蛋白。采用NanoDrop检测蛋白浓度，得到本批次His-Ub-Ub-Flag蛋白浓度为1.21 mg/ml。将每步留样蛋白依次上样电泳，用考马斯亮蓝染色法检测蛋白表达纯化结果，洗脱后得到符合分子量的蛋白条带（图2）。

化合物2,6-二氨基-3,5-二硫氰基吡啶（2,6-Diamino-3,5-dithiocyanopyridine，PR619）可诱导细胞中多泛素化蛋白的积累，是非选择性且可逆的去泛素化酶抑制剂。文献报道PR619抑制多个DUBs蛋白的活性，如USP4（EC₅₀=3.93 μmol/L），USP8（EC₅₀=4.90 μmol/L），JOSD2（EC₅₀=1.17 μmol/L），UCH-L3（EC₅₀=2.95 μmol/L）^[17-18]。经酶活评价验证，PR619具有浓度依赖性且可稳定抑制OTULIN蛋白的阳性对照药，其对OTULIN蛋白的EC₅₀值为16.8 μmol/L（图3）。

选用OTULIN活性片段（OTULIN^80-352，分子量31 000），底物蛋白His-Ub-Ub-Flag，分子量20 500，阳性对照化合物PR619，空白对照DMSO。首先考察酶与底物蛋白在不同用量比下的酶活效率。将OTULIN^80-352与PR619室温孵育，再加入底物蛋白His-Ub-Ub-Flag，37℃水浴孵育，电泳检测后用考马斯亮蓝染色法观察结果。根据实验结果，选择OTULIN^80-352与底物蛋白His-Ub-Ub-Flag的用量比为1∶16，可清晰见到达酶切反应平衡的蛋白条带（图4）。

将30 μmol/L PR619与OTULIN^80-352蛋白室温孵育30 min，加入相应的底物蛋白在37℃水浴下反应。电泳检测，考马斯亮蓝染色后对比观察。水浴37℃中反应10 min，酶切下的His-Ub条带不清晰，提示反应作用时间过短，水解不充分。当反应20 min时，可以明显观察到被OTULIN水解后的His-Ub蛋白。当反应30、40、60 min时，并无明显差异。为考察实验操作的一致性，每组条件设置2组DMSO组，为提高实验效率，选择酶水解底物反应条件为37℃，作用20 min，结果见图5。

在众多的PTM类型中，线性泛素化因其独特的Met1连接方式，在NF-κB信号通路激活及炎症反应中发挥特异性作用。OTULIN作为该PTM的唯一已知逆转酶，其酶活性的精确调控直接决定了线性泛素化信号的强度与持续时间。为了建立高效的OTULIN活性检测体系，本研究首次成功构建、表达并纯化了线性泛素底物His-Ub-Ub-Flag。通过对酶与底物用量比及反应时间的梯度优化，确立了最佳酶促反应动力学窗口，在OTULIN蛋白与底物蛋白His-Ub-Ub-Flag用量是1:16，37℃孵育20 min达到反应平衡，并采用广谱去泛素化酶抑制剂PR619作为阳性对照药物进行验证。实验结果显示，阳性对照药物PR619对OTULIN活性表现出明显的剂量依赖性抑制作用，证明了该体系对抑制剂检测的稳定性和灵敏度。利用构建的线性泛素蛋白底物，能有效评价去线性泛素化酶OTULIN的体外分子水平生物活性。

新药靶点的发现与确证是现代医药创新的核心驱动力。在众多药物类型中，小分子药物凭借其优良的理化性质及卓越的细胞膜透过能力，在靶向细胞内蛋白方面展现出天然优势。本研究聚焦的去线性泛素化酶OTULIN，作为线性泛素化这一特殊蛋白质翻译后修饰的唯一特异性逆转酶，在维持PTM动态平衡、调控NF-κB信号通路及先天免疫稳态中发挥着不可替代的作用。鉴于OTULIN功能异常与肿瘤及免疫疾病的密切关联，开发针对该靶点的特异性小分子抑制剂具有重要的转化医学价值。

本研究致力于解决OTULIN靶向药物筛选的方法学难题，成功构建了一套稳定、精准的体外活性评价体系，实现了对候选化合物抑制效应的定量评估。该体系的建立，不仅为解析OTULIN介导的PTM去修饰机制提供了有力工具，更为后续针对该潜在新药靶点开展高内涵、高通量的药物筛选提供了全新的技术方法。