Preparation and properties of Zanthoxylum alkaloids thermosensitive hydrogel

花椒药材（批号：20220705-2，购于陕西省渭南韩城市），经海军军医大学张成中副教授鉴定为芸香科花椒属红花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）的干燥果皮。

安捷伦Cary-100紫外-可见分光光度计（安捷伦科技有限公司）；布鲁克Tensor Ⅱ红外光谱仪（布鲁克科技有限公司）；ZEM20扫描电子显微镜（安徽泽攸科技有限公司）；RE-2000E旋转蒸发器（上海东玺制冷仪器设备有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（巩义市予华仪器有限责任公司）；XS205DU电子分析天平（梅特勒托利多科技公司）。

95%乙醇（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）；二甲基亚砜（分析纯，上海碧云天生物技术有限公司）；泊洛沙姆407（生物试剂，上海泰坦科技股份有限公司）；泊洛沙姆188（生物试剂，北京阿词玛生物科技有限公司）；HP-20型大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）。

将花椒药材粉碎，过40目筛。称取60 g过筛后的花椒粉末置于圆底烧瓶中，按照料液比1∶10的比例加入50%乙醇，进行回流提取，提取3次，每次1 h，提取液抽滤后合并，旋转蒸发浓缩后，置于4℃冰箱，备用^[19]。

选用HP-20型大孔吸附树脂，上样液稀释至300 ml，树脂体积为150 ml，树脂柱径高比为1∶7，以每小时600 ml的速率动态吸附，静置1 h，随后使用300 ml 20%乙醇除杂处理，使用750 ml 80%乙醇洗脱，收集洗脱液。50℃旋转浓缩后，转移至蒸发皿中40~50℃加热至浓稠状，40℃真空干燥，研磨得到花椒生物碱有效部位的粉末，收集备用^[19]。

（1）专属性考察

取适量花椒生物碱有效部位粉末、花椒生物碱温敏水凝胶和空白温敏水凝胶溶于50%乙醇，以50%乙醇为空白对照，采用紫外-可见分光光度法进行200~400 nm全波长扫描，在最大吸收峰处进行单点测量，考察水凝胶基质是否干扰其测定。

（2）标准曲线的绘制

精密称取10 mg花椒生物碱有效部位粉末，置于25 ml量瓶中，用50%乙醇定容并摇匀，即得储备液（质量浓度为400 μg/ml），备用。分别精密量取25、112、200、285、375 μl的储备液置于10 ml量瓶中，用50%乙醇定容并摇匀，采用紫外-可见分光光度法，在最大吸收波长处测定吸光度，平行测定3次。以浓度（μg/ml）为横坐标，吸光度A为纵坐标，求得回归方程、相关系数。

精密称取处方量的P407和P188，加入适量去离子水，在室温下采用磁力搅拌器溶解至溶液澄清。精密称定处方量的生物碱有效部位粉末，用少量DMSO溶解后加入其中。置于4℃冰箱，充分溶胀24 h后，即得透明澄清的花椒生物碱温敏水凝胶。

采用倾斜西林瓶法^[20]测定该温敏水凝胶的胶凝温度。取在4℃冰箱中溶胀好的水凝胶溶液5 ml，置于10 ml西林瓶，将西林瓶置于恒温水浴锅中，从25℃开始缓慢升温，每升高1℃恒温5 min，每隔10 s倾斜45°，观察西林瓶内凝胶溶液的流动情况。待西林瓶中的溶液不随西林瓶倾斜而流动时，将水银温度计插入测量温度，此时的温度即为胶凝温度。

分别以P407、P188及花椒生物碱的质量浓度为考察因素，胶凝温度为评价指标。每个因素设计3个水平，按照L9（3³）设计正交试验，并对实验所得数据进行方差分析，以确定花椒生物碱温敏水凝胶的最佳处方。正交试验的因素及其水平见表1。

由正交试验筛选出花椒生物碱温敏水凝胶的最优处方，并根据该处方平行制备3批花椒生物碱温敏水凝胶。以胶凝温度（即该温敏水凝胶发生构象变化，由液态变为凝胶态时的温度）为考察指标，考察该处方的工艺稳定性。

在室温下和34℃时，分别观察花椒生物碱温敏水凝胶的颜色特征及其流动性。量取5 ml花椒生物碱温敏水凝胶，按照“2.4”的方法测定其胶凝温度。平行测定3次，计算平均值。量取5 ml花椒生物碱温敏水凝胶，置于10 ml西林瓶中，将西林瓶置于34℃恒温水浴锅中，并开始计时，每隔10 s倾斜45°，观察西林瓶内凝胶溶液的流动情况，待西林瓶中的溶液不随西林瓶倾斜而流动时，记为胶凝时间（s）^[21]。平行测定3次，取平均值。

将P407/P188空白温敏水凝胶和花椒生物碱温敏水凝胶冻干处理，即−80℃预冻24 h后，置于真空冷冻干燥机中冷冻48 h后，即得冻干品。取适量花椒生物碱温敏水凝胶的冻干品，喷金后使用扫描电子显微镜（SEM）观察其形貌。

此外，分别取适量P407、P188和空白温敏水凝胶，与干燥的溴化钾按1∶100混合并研制成粉末，压片。采用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）对P407、P188及P407/P188空白凝胶进行测定。

（1）生物黏附性

取适量所制备的花椒生物碱温敏水凝胶，分别置于塑料离心管与西林瓶中；另取适量水凝胶均匀涂布于丁腈手套及皮肤表面；再取适量水凝胶装入10 ml离心管中。将上述样品在37℃水浴中平衡10 min后，倒置离心管，将钢制砝码吸附于凝胶表面，考察水凝胶对不同材质的黏附性。

另取5 ml花椒生物碱温敏水凝胶置于50 ml离心管管盖内，垂直放入不同克重的砝码，于37℃下静置10 min。倒置管盖并开始计时，当砝码从管盖中掉落时，停止计时，并记录5ml水凝胶对该克重砝码的黏附时长。

（2）抗张强度

参照文献[22]中指关节伸展实验方法，对制备的水凝胶进行机械性能评估。

（3）自愈合性能

参照文献[23]的方法，取适量水凝胶涂敷于手背皮肤，待其成胶凝固后，将其切开并重新贴合切面，观察其在无外力辅助下能否自发融合。

采用无膜溶出法^[24]测定水凝胶的体外释放行为。取最优处方制备的花椒生物碱温敏水凝胶3 ml置于10 ml 离心管中，于37°C水浴中静置30 min使其完全胶凝。随后缓慢加入等体积（3 ml）经37°C预热的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4），并将整个体系转移至37℃水浴中进行释放实验。

于设定时间点0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120 h各取出2 ml释放溶液，并立即补加上述等温等体积的新鲜PBS。取出的样品置于10 ml容量瓶中，用50%乙醇稀释定容。以相同比例的PBS-50%乙醇溶液为空白对照，在花椒生物碱的最大吸收波长下测定各个样品溶液的吸光度，计算花椒生物碱的体外累计释放率（%），并拟合释放动力学曲线。

本研究采用回流提取法获得粗提取物后，利用大孔吸附树脂进行富集纯化，最终得到花椒生物碱有效部位，其为棕褐色、有光泽的固体粉末。经计算，最终产品的得率为10.02%（表2）。

由于水凝胶基质对花椒生物碱的定量检测无干扰，因此可采用紫外-可见分光光度法对温敏水凝胶中的花椒生物碱进行含量测定，结果如图1所示。测定波长为花椒生物碱的最大吸收波长270 nm。

以花椒生物碱吸光度（A）对质量浓度（c，μg/ml）进行线性回归，得回归方程：A=0.058c－0.010 4，r=0.998 7。结果表明，花椒生物碱质量浓度为1~15 μg/ml，吸光度与质量浓度线性关系良好。

以胶凝温度为指标，对不同处方花椒生物碱温敏水凝胶的考察结果如表3所示。分析表明，胶凝温度随基质P407浓度增大而降低，随P188浓度增大而升高。根据正交试验结果，理论最佳处方为A₁B₃C₂，然而其胶凝温度（40℃）高于人体体表适宜温度范围（30~37℃），该处方不符合实际应用需求。

方差分析结果（表4）显示，各因素对胶凝温度的影响顺序为：P407浓度（A）>P188浓度（B）>花椒生物碱浓度（C），且P407浓度的影响具有显著性，而P188与花椒生物碱浓度的影响不显著。这表明P407是调控胶凝温度的主导因素。

因此，为降低胶凝温度，提高P407浓度，调整处方为A₂B₃C₂，即：20%（g/ml）P407，2%（g/ml）P188和100 μg/ml花椒生物碱。

根据正交试验筛选出的最优处方，平行制备了3批水凝胶以验证工艺稳定性。测得三批样品的胶凝温度分别为32℃、33℃、33℃，符合人体体表温度范围（30~37℃），且3批间数据差异小，表明该处方工艺稳定、重现性良好。

该花椒生物碱温敏水凝胶表现出典型的温度响应性，室温下为液体，当环境温度升至33℃以上时，即可转变为浅黄色透明的半固体凝胶，而将此凝胶置于4°C低温环境时，可发生胶溶，恢复为透明液体。胶凝温度测定结果如表5所示，花椒生物碱温敏水凝胶的平均相转变温度（胶凝温度）为32.6℃，平均胶凝时间为143.3 s。以上结果表明，该水凝胶具有适宜且可控的温敏胶凝特性。

SEM扫描结果如图2所示，图2A（1）是空白温敏水凝胶的表面微观结构，图2A（2）是其断面微观结构；图2B（1）是花椒生物碱温敏水凝胶的表面微观结构，图2B（2）是花椒生物碱温敏水凝胶的断面微观结构。SEM图像显示，温敏水凝胶具有丰富的层状和网状结构，有利于药物的负载与缓释^[25]。相比之下，负载花椒生物碱的水凝胶其三维网络结构明显更加致密，这可能是由于花椒生物碱分子填充了水凝胶的网络空腔，并与高分子链发生相互作用，改变了网络的交联状态，间接表明本研究已成功制备了携载有花椒生物碱的温敏水凝胶。

P407、P188和空白温敏水凝胶的FT-IR光谱如图3所示，空白温敏水凝胶具有P407和P188中的-C-H伸缩振动吸收峰（2 886 cm⁻¹），以及醚键-C-O-C-的不对称伸缩振动吸收峰（1 113 cm⁻¹）。FT-IR光谱显示，空白温敏水凝胶的红外特征峰为其基质材料（P407与P188）的叠加，且未出现新的特征吸收峰，表明各组分间以物理方式结合，相容性良好。

花椒生物碱温敏水凝胶展现出良好的力学性能与自愈合能力。该水凝胶具有良好的生物黏附性，如图4A所示，它能够牢固地吸附于丁腈、玻璃、塑料、人体皮肤乃至钢制砝码等多种材料表面；黏附力测试结果如图4B所示，其黏附时长随负载砝码克重的增加而逐渐下降，显示出一定的承重潜力。同时，水凝胶具备较好的柔性与可拉伸性，如图4C所示，贴附于指关节的水凝胶能够随关节的弯曲伸展而自由变形，不妨碍正常关节活动，对使用者影响甚微。此外，该水凝胶还拥有高效的自愈合能力，如图4D所示，被切开的两部分在接触后无需外力即可自发融合，能在约5 min内恢复黏合状态，证明了其快速自我修复的特性。

花椒生物碱温敏水凝胶中花椒生物碱的体外释放曲线如图5所示。花椒生物碱在释放初期存在快速释放现象，24 h的体外释放率为28.94%，在后续数天内能够缓慢持续释放药物，此释放模式证实了该水凝胶在实现药物快速起效的同时，具备良好的长效缓释特性。由表6可知，花椒生物碱温敏水凝胶的体外释放更符合Higuchi方程。

本研究采用P407和P188作为温敏水凝胶基质，成功制备了载花椒生物碱的温敏水凝胶。在质量浓度对胶凝温度的影响试验中，将P407浓度从18%（g/ml）提升至20%（g/ml），胶凝温度从40℃优化至适于人体应用的32.6℃，胶凝温度随着P407质量浓度的升高而降低，可能是由于 P407在水溶液中的胶凝机制所致^[26-28]。通过正交试验优化，凝胶的最优处方确定为20%（g/ml）P407、2%（g/ml）P188和100 μg/ml花椒生物碱。

本研究制备的花椒生物碱温敏水凝胶在4~25℃为液体，当环境温度大于33℃时即可形成凝胶，最优制备工艺下制备的3批花椒生物碱温敏水凝胶的平均胶凝温度为32.6℃，平均胶凝时间为143.3 s，符合应用要求。此外，通过力学性能试验的考察，证实该研究制备的花椒生物碱温敏水凝胶，兼具良好生物黏附性与自愈合能力，可紧密贴合皮肤与关节并在受损后自行修复，显著延长作用时间。温敏水凝胶的形成对花椒生物碱的体外释放起到一定的缓释作用，体外释放符合 Higuchi方程，表明花椒生物碱的释放主要受扩散控制，且释放过程相对稳定，初始24 h内存在突释效应，随后进入持续数天的缓释阶段，确保药物在体内持续、稳定地释放，从而达到治疗效果^[29]。

综上所述，本研究表明花椒生物碱温敏水凝胶具有良好的力学性能和缓释效果，为局部抗炎等场景的给药提供了新型制剂选择，展现出良好的应用潜力。