-
肌肉疲劳通常指肌肉因反复收缩活动而出现的肌力可逆性下降[1]。与此相关，肌肉在一段时间内重复执行收缩以抵抗疲劳的能力，或是长时间维持特定最大自主收缩百分比的能力也被称为肌肉耐力[2]。军事训练、长时间的战斗或不适当的运动都会引起肌肉疲劳，引发肌肉耐力下降，从而影响军事行动和运动成绩[2]。肌肉疲劳通常是急性的，休息后可缓解；也可以是慢性和持续性的，常继发于衰老、制动、药物或疾病，严重时甚至影响生活质量[3]。由于缺乏特异的靶标，目前并无肌肉耐力提升药物上市，安非他明、莫达非尼和咖啡因可以显著改善疲劳，但实质为中枢兴奋剂，存在成瘾、耐受、影响生物节律等风险[4]；人参、红景天等天然产物以及维生素和矿物质等营养物质，效果缓慢而不显著，市场亟需靶点明确的抗疲劳药物。
Orosomucoid（ORM）也称α1-酸性糖蛋白（α1-acid glycoprotein，AGP），是一组主要在肝脏合成的分泌蛋白，小鼠中有3种亚型：ORM1, ORM2 和ORM3，而人体中有2种亚型：ORM1和ORM2，其中，ORM1是主要亚型。团队前期研究发现，ORM1是一种内源性的抗疲劳蛋白[5-6]，各种形式的疲劳均可诱导肝脏和血清中的ORM显著增加，如啮齿类动物的强迫游泳、跑台和睡眠剥夺模型，以及慢性疲劳综合征人群[5-6]。且ORM1可以正反馈作用于骨骼肌细胞膜上C-C趋化因子受体5型受体（CCR5），并激活腺苷酸活化蛋白激酶（adenylate-activated protein kinase，AMPK），增加肌糖原含量，从而提升肌肉耐力[5-11]。然而ORM需要从血浆中制备，并通过静脉注射给药[12]，故难以成药。因此，我们试图寻找一种可以刺激内源性ORM1增加、进而抗肌肉疲劳的药物。
团队前期通过高通量筛选，发现橄榄油提取物橄榄苦苷具有提升肝细胞ORM1表达的潜力，提示其可能具有抗肌肉疲劳活性。橄榄苦苷作为一种天然酚类化合物，其抗炎、抗氧化、神经保护及抗肿瘤等多种药理作用已被广泛研究[13-16]，这为其应用于缓解肌肉疲劳提供了潜在的药理学依据。为本研究将进一步确定橄榄苦苷对ORM蛋白表达的促进作用，并评估橄榄苦苷对肌肉耐力的影响，以期为耐力提升药物研发提供新的候选分子。
-
ORM1、β-Actin、β-Tubulin抗体以及兔二抗购自武汉三鹰公司；化合物橄榄苦苷（97%）购自上海源叶公司；肝糖原、肌糖原检测试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物公司。ORM1 ELISA试剂盒购自美国Abcam公司,其他试剂以及仪器设备由本实验室提供。
-
小鼠肝细胞系AML12，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。培养液配方：DMEM/F12、10%FBS、10 μg/ml 胰岛素、5.5 μg/ml转铁蛋白、5 ng/ml硒、40 ng/ml 地塞米松以及 1%青链霉素双抗（P/S）。培养条件：5%CO2、37℃恒温孵育箱。用PBS溶液配置浓度30 mmol/L的橄榄苦苷母液，稀释1 000倍后得到的浓度为30 μmol/L工作液，依次梯度稀释3倍后得到浓度为0.3、1、3、10、30 μmol/L工作液，当细胞生长至对数分裂期即进行给药。
-
C57BL/6J 雄性小鼠109只，周龄6～8周，体重（20±2）g，购自杭州子源实验动物科技有限公司，动物实验许可证号：SYXK（沪）2017-0004。小鼠在恒定温度（22℃）和相对湿度（70%）的环境中饲养，12 h光/暗循环照明，8时至20时为照明时间，小鼠可自由获得食物和水。该实验由海军军医大学动物实验伦理委员会批准，所有动物均得到了人道关怀，实验程序严格按照海军军医大学机构动物护理指南进行。
-
77只小鼠随机分为11组，每组7只。其中6组用于药物量效性研究，根据给药剂量不同分为0、1、3、10、30、100 mg/kg剂量组；剩余5组用于药物时效性研究，根据给药天数不同分为0、1、3、7、14 d组。剩下32只小鼠随机分为4组，每组8只，根据上述结果确定最佳给药时间和剂量后给药，用于研究非运动状态下药物对小鼠的影响。将橄榄苦苷溶于生理盐水中，制备不同浓度的橄榄苦苷溶液，按照容积0.1 ml/10 g，通过灌胃给药的方式，适应性喂养1周后给药。按不同给药剂量对小鼠给药7 d，每天一次，随后进行实验；确定最佳给药剂量后，按计划天数给药，每天一次，随后进行实验。转棒实验结束后，小鼠休息7 d，随后按以往分组重新给药后进行负重强迫游泳实验。
-
小鼠于正式测试前进行3 d的适应性训练，分为3个阶段，3个阶段之间无时间间隙：T1阶段，转棒以加速度5 r/min2从静止开始匀加速至速度为5 r/min;T2阶段，更改加速度为10 r/min2，加速至15 r/min后匀速转动2 min;T3阶段，继续以加速度10 r/min2加速至20 r/min后继续匀速2 min。若小鼠在测试过程中掉落，记录掉落时间，待20 min后重新对掉落小鼠开始实验，记录小鼠在转棒上持续的时间。小鼠在进行适应性实验期间训练小鼠体力，加强小鼠的协调能力。正式实验阶段，T1、T2、T3各阶段加速度不变，结束时匀速速度分别达到5、15、18 r/min，记录小鼠转棒持续时间[17]。
-
小鼠于正式测试前进行3 d适应性训练，将小鼠放置在圆柱形玻璃器皿中，该器皿填充了40 cm深的21～23℃的水，以防止小鼠尾巴接触底部。在每只小鼠尾端3 cm处系上一个金属环，适应性训练的第1、2、3天，小鼠负重自身体重的3%，在水中分别进行10、20、30 min游泳训练。正式测量时，负重5%，测量从小鼠进入水中开始，在沉入水下10 s后结束[18]。
-
取小鼠腓肠肌和比目鱼肌于4%多聚甲醛中固定24 h后，常规石蜡包埋切片处理，随后PAS染色观察肌肉形态及糖原含量。
-
取小鼠肝脏组织20～30 mg，放入2 ml研磨管中，按照1∶10比例加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液，研磨离心后取上清液，BCA法蛋白定量后经SDS-PAGE分离，蛋白电转至PVDF膜，将PVDF膜在5%牛奶中封闭1 h，加入1∶1 000的一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤，加入酶标二抗室温1 h，PVDF膜置于化学发光图像分析仪进行拍摄保存。
-
实验数据采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计与分析。各组数据以均数±标准差（$ \overline{x} $±s）表示，如各组数据满足正态性和方差齐性，两组之间采用独立样本t检验，多组间采用单因素方差分析；如服从正态分布不满足方差齐性，选用Welch矫正后的ANOVA检验；若不服从正态分布，则进行非参数检验，采用Kruskal-Wallish检验法进行比较。整个分析过程中，以P<0.05为差异具有统计学意义。
-
为验证橄榄苦苷能否在肝细胞中提升ORM1表达，首先进行时间-效应研究，即在统一收样前0、2、6、12、24、48 h加入相同浓度的橄榄苦苷，首次给药浓度根据文献报告选用10 μmol/L[19]。结果显示，给橄榄苦苷后2 h即有上升趋势，6～24 h之间，肝细胞中ORM1的含量显著提高，在12 h时，该效应到达高峰（图1A、1B）；在确定最佳时间为12 h后，进行剂量-效应研究，即给药浓度设置0.3、1、3、10、30 μmol/L。结果显示，在0.3 μmol/L剂量下即有提升趋势，当橄榄苦苷剂量在1、3 μmol/L时，肝细胞中ORM1的含量显著提高（图2A、2B）。
-
橄榄苦苷在体外实验中能稳定促进抗疲劳靶蛋白ORM1提升，强烈提示该药物具有抗肌肉疲劳的潜力，继续体内实验，研究药物对肌肉耐力的影响。首先采用转棒实验对小鼠进行评估。转棒实验作为一种行为学测试，通过小鼠在转棒上停留时间的变化，来评估运动能力，从而间接反映肌肉疲劳情况[20]。该实验依赖小鼠的平衡协调能力，适应性训练可以帮助小鼠掌握“主动踏步”策略，也是确保实验数据可靠的关键，避免因技能缺失导致的假阳性结果。采用渐进增加转速的方式，每天上午、下午各训练30 min，训练3 d，具体适应给药流程图如图3A所示。不同给药剂量下，小鼠转棒停留时间部分服从正态分布，采用Kruskal-Wallis检验，实验结果显示，在10、30、100 mg/kg的给药剂量下，小鼠在转棒上停留的时间显著延长（图3B）；选取30 mg/kg作为最佳剂量，分别给药1、3、7、14 d，小鼠转棒停留时间服从正态分布，但未通过方差齐性检验（P<0.05），选用Welch矫正后的ANOVA检验，结果显示，给药超过1 d以上，小鼠在转棒上停留时间即呈延长趋势，给药≥7 d时差异显著（图3C）。
-
小鼠休息7 d后重新给药，给药结束后进行负重游泳实验（图4A）。负重游泳实验作为一种动物行为学测试，通过测量动物在特定负重下游泳的总时间或力竭时间，可以间接反映其肌肉在持续运动状态下的耐力表现，进而用于评估肌肉疲劳。不同剂量或不同给药时间下，小鼠负重游泳时间均符合正态分布，并通过方差齐性检验（P>0.05），进行单因素方差分析。结果显示，在剂量为10～100 mg/kg，给药7天的情况下，小鼠游泳时间显著延长（图4B），基于量效实验结果，选取最佳剂量（中间剂量）30 mg/kg进行时效研究。随后，分别给药1、3、7 d发现，小鼠的负重游泳时间呈延长趋势，且当给药时间≥3 d时均存在差异显著（图4C）。
-
近年来，越来越多的研究证实了糖原与肌肉疲劳之间的关系，糖原作为骨骼肌中的主要能量储备，其水平直接影响肌肉的耐力和疲劳程度，增加糖原含量可以显著改善肌肉耐力[5,21]。本团队前期研究发现，ORM1可以通过增加肌肉糖原含量来提高肌肉耐力。因此，在这里我们试图探索橄榄苦苷是否有类似的效应。采用未进行任何人为运动干预小鼠作为研究对象，通过糖原检测试剂盒检测肝脏和肌肉组织的糖原含量。肝脏或肌肉中糖原含量均符合正态分布，并通过方差齐性检验（P>0.05），采用单因素方差分析发现，橄榄苦苷在30 mg/kg时显著增加肝脏中糖原含量（图5A），在30～100 mg/kg剂量范围内显著增加肌肉糖原含量（图5B）；通过碘酸雪夫染色（Periodic Acid-Schiff，PAS），对橄榄苦苷给药后的肌肉组织进行糖原含量的观察。实验结果表明，与0 mg/kg组相比，给药组中代表糖原的洋红色染色部分颜色更深，染色区域明显增大，并在30 mg/kg剂量组最为明显（图6）。
-
通过2种模型确认橄榄苦苷的抗肌肉疲劳效应后，我们进一步探究橄榄苦苷能否在体内提升ORM1表达。ORM1主要由肝脏分泌，入血后进入效应器官。因此，这里使用蛋白免疫印迹分析技术检测肝脏组织中的ORM1，并使用ELISA技术检测血清中ORM1。选择10、30、100 mg/kg作为研究剂量，无任何人为运动干预小鼠经过适应性饲养后，通过灌胃给药7 d后，解剖小鼠得到血清和肝脏组织并进行检测。所有均符合正态分布，且通过方差齐性检验（P>0.05），采用单因素方差分析发现，肝脏（图7A、7B）和血清（图7C）中的ORM1含量均显著升高。
-
目前，针对肌肉疲劳的特定药物尚未问世，原因在于缺乏明确的靶点。非特定的治疗手段，如营养补充剂、免疫疗法（例如IgG和干扰素α2），以及药物（如类固醇、莫达非尼和咖啡因），虽已在实验中被广泛应用，但在多项研究中往往显示出微弱、无结论或负面的效果[22-26]。自20世纪初以来，研究逐渐揭示了碳水化合物作为运动燃料的重要性，肌肉糖原对运动表现的关键作用在众多研究中得到了充分证实。当糖原储备不足时，肌肉耐力将显著下降。进一步的研究表明，糖原的减少直接导致肌浆网中Ca2+的释放减少，从而影响肌肉的收缩能力与疲劳程度[27]。因此，改善能量代谢，尤其是提升糖原含量，或许是治疗肌肉疲劳的有效途径。
基于团队之前的发现，内源性抗疲劳蛋白ORM1通过CCR5-AMPK通路提升肌肉中的糖原含量与运动耐力。本研究结果表明天然化合物橄榄苦苷不仅展现出抗疲劳的显著效果，同时也能够显著提升体内ORM1蛋白的表达水平及骨骼肌中的糖原储备。此结果提示，橄榄苦苷的抗疲劳功能与调节ORM1的表达密切相关。
综上所述，本研究以橄榄苦苷与靶蛋白ORM1之间的关系为切入点，对小鼠在给药后的运动耐力变化进行了细致评估，明确指出橄榄苦苷能够显著提升肌肉耐力，展现出其抗疲劳的潜力。这为橄榄苦苷在治疗肌肉疲劳方面提供了坚实的科学依据。然而，文中尚未验证橄榄苦苷是否通过ORM1发挥其抗疲劳的功能，未来的研究将进一步采用ORM1基因敲除鼠进行深入评估，以探讨橄榄苦苷对ORM1的具体调控机制。
Study on the role of oleuropein in enhancing muscle endurance
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202510011
- Received Date: 2025-10-11
- Accepted Date: 2026-02-11
- Rev Recd Date: 2026-01-26
- Available Online: 2026-03-09
-
Key words:
- oleuropein /
- muscle fatigue /
- orosomucoid1（ORM1） /
- glycogen /
- muscle endurance
Abstract:
| Citation: | LI Huan, ZHANG Zhen, FENG Jiayi, ZHANG Weidong, LIU Xia. Study on the role of oleuropein in enhancing muscle endurance[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202510011
|
DownLoad:
