Study on bacterial endotoxin limit value and the detection methodological investigation for the active pharmaceutical ingredient of pentetic acid

SHEN Juan; TIAN Ying; NI Ming; LIU Ju; YU Mengmeng

doi:10.12206/j.issn.2097-2024.202508061

Objective To explore and establish the bacterial endotoxin limit value and testing method of the active pharmaceutical ingredient （API） of pentetic acid, and conduct methodological investigation. Methods Three batches of pentetic acid were used to establish the method for the determination of bacterial endotoxin, and interference test was conducted simultaneously. The sample was dissolved with commercially available alkaline regulator to a concentration of 4 mg/ml or lower, and then diluted with water for bacterial endotoxin test. Limulus reagent with sensitivity of 0.125 EU/ml or higher was selected and redissolved with commercially available magnesium ion buffer solution. And the endotoxin test was performed by gel method. Results The endotoxin limit of API of pentetic acid was determined as: less than 0.125 EU/mg. Conclusion The method established could be used for the control of bacterial endotoxin in API of pentetic acid.

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喷替酸^[1]（DTPA），又名二亚乙基三胺五乙酸，为氨羧酸类化合物，微溶于冷水，溶于热水和碱溶液，pH 2～3（在20℃的饱和溶液中）化学性质稳定。其三钠钙盐和三钠锌盐于2004年8月由美国FDA批准上市^[2]，用于放射性核素沾染后的治疗，是广谱的放射性核素促排药物，是目前应用最广、效果最好的氨羧络合剂。《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）历版中均未收载喷替酸的质量标准，美国药典（USP）自第32版起，历版药典均收载了喷替酸的质量标准^[3-4]，但标准中未设置细菌内毒素检查项。在某项以喷替酸为原料药研制注射剂的项目中，在该注射剂的质量标准中设置了细菌内毒素检查项，按照审评的要求，为了做好全生命周期管理，应从源头起做好质量控制，故对原料药同步设置细菌内毒素检查项。基于此，本试验拟对喷替酸原料药的细菌内毒素限值进行确定，同时对其鲎试剂凝胶法检查方法进行研究，探索建立喷替酸原料药内毒素检验的质量标准。

1. 材料

1.1. 试剂

细菌内毒素工作标准品（批号：150601-202190，每支70 EU，中国食品药品检定研究院）；细菌内毒素检查用水（批号：160006-201510，每支5 ml，BET水，中国食品药品检定研究院）；鲎试剂（批号：21030312，0.1 ml/支，TAL 0.125 EU/ml，福州新北生化工业有限公司；批号：2211211， 0.1 ml/支，湛江安度斯生物有限公司）；镁离子缓冲液（批号：2203020，每支4 ml，湛江安度斯生物有限公司）；碱性调节剂（2 ml/支，湛江博康海洋生物有限公司）。

1.2. 供试品

喷替酸（批号：220501、220502、220503，装量：10.0 mg/支，某药品生产单位）。

1.3. 仪器及器具

SSW-600-2S电热恒温水浴箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；微量移液器（规格：200 μl、1000 μl， Eppendorf公司）；MS 3数字漩涡振荡器（德国IKA公司）；无热原吸头；经250℃干烤1 h的试管。

2. 方法

2.1. 限值的确定

本品拟研制的注射剂最大给药剂量为800 mg/（60 kg·h）。根据《中国药典》（四部）2020年版通则1143^[5]，计算出限值L=0.375 EU/mg。根据《中国药典》（四部）2020年版《注射剂安全性检查法应用指导原则》^[5]，为保证用药安全，将限值严格至计算值的1/3，即以0.125 EU/mg为限值进行细菌内毒素方法的可行性考察。

2.2. 鲎试剂灵敏度复核试验

按照《中国药典》（四部）2020年版通则1143^[5]进行鲎试剂灵敏度（λ_c）复核。2批鲎试剂灵敏度测定值均符合要求，见表1。

鲎试剂批号	标示灵敏度（λ_c，EU/ml）	内毒素浓度（EU/ml）					实测λ_C （EU/ml）
鲎试剂批号	标示灵敏度（λ_c，EU/ml）	0. 25	0. 125	0.06	0.03	阴性对照	实测λ_C （EU/ml）
2211211	0. 125	++++	++++	− − − −	− − − −	− −	0.125
21030312	0. 125	++++	++−+	− − − −	− − − −	− −	0.150

2.3. 干扰试验预试验

2.3.1. 喷替酸最大有效稀释倍数

根据最大有效稀释倍数（MVD）公式MVD= cL/λ：L为0.125 EU/mg；c为拟配制供试品浓度4 mg/ml。常用市售鲎试剂灵敏度λ范围0.5～0.03 EU/ml，0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 EU/ml的鲎试剂分别对应的供试品溶液有效稀释倍数：1、2、4、8、16倍，分别对应有效稀释浓度：4、2、1、0.5、0.25 mg/ml。

拟用0.125 EU/ml灵敏度（对应的供试品有效稀释浓度为1 mg/ml）的鲎试剂进行测定。

2.3.2. 试验操作及结果

首先探索用市售的镁离子缓冲液将供试品旋涡混合溶解并稀释进行试验。

分别用镁离子缓冲液2.5 ml将10.0 mg供试品旋涡混合溶解成4 mg/ml，用镁离子缓冲液进一步稀释成2、1、0.5、0.25 mg/ml浓度的供试液，此系列浓度溶液记为A。

另制备含有2λ（0.25 EU/ml）细菌内毒素的2、1、0.5、0.25 mg/ml浓度的供试液，此系列溶液记为B。

取灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂，用镁离子缓冲液0.1 ml复溶，分别与上述A和B进行反应，设置复管，并设阳性（PC）和阴性对照（NC），结果见表2。

供试品批号	A（供试品稀释液）				B（供试品稀释液+内毒素）				NC（W）	PC（E_2λ）
供试品批号	S₂	S₁	S_0.5	S_0.25	S₂E_2λ	S₁E_2λ	S_0.5E_2λ	S_0.25E_2λ	NC（W）	PC（E_2λ）
220501	− −	− −	− −	− −	− −	− −	+−	+−	− −	++
220502	− −	− −	− −	− −	− −	− −	−+	+−
220503	− −	− −	− −	− −	− −	− −	−+	−+
注：S₂表示供试品浓度为2 mg/ml稀释液，下标表示溶液浓度；E_2λ表示内毒素的浓度为2倍λ浓度（0.25 EU/ml）；W为细菌内毒素检查用水。

表2结果表明：供试品用镁离子缓冲液溶解并稀释，鲎试剂用镁离子缓冲液复溶，对鲎试剂和内毒素的凝集反应存在干扰。

考虑到供试品pH在2～3，继续探索使用市售的碱性调节剂将供试品旋涡混合溶解成4 mg/ml供试品溶液，再用BET水稀释。按表2同样的方法进行操作，结果见表3和表4。

供试品批号	A（供试品稀释液）				B（供试品稀释液+内毒素）				NC（W）	PC（E_2λ）
供试品批号	S₂	S₁	S_0.5	S_0.25	S₂E_2λ	S₁E_2λ	S_0.5E_2λ	S_0.25E_2λ	NC（W）	PC（E_2λ）
220501	− −	− −	− −	− −	+−	++	++	++	− −	++
220502	− −	− −	− −	− −	++	++	++	++
220503	− −	− −	− −	− −	++	++	++	++

供试品批号	A（供试品稀释液）				B（供试品稀释液+内毒素）				NC（W）	PC（E_2λ）
供试品批号	S₂	S₁	S_0.5	S_0.25	S₂E_2λ	S₁E_2λ	S_0.5E_2λ	S_0.25E_2λ	NC（W）	PC（E_2λ）
220501	− −	− −	− −	− −	− −	++	++	++	− −	++
220502	− −	− −	− −	− −	− −	++	++	++
220503	− −	− −	− −	− −	− −	++	++	++

表3和表4结果表明：供试品预先用碱性调节剂溶解成4 mg/ml并用BET水稀释，在1 mg/ml及以下浓度溶液对试验无干扰。1 mg/ml浓度与0.125 EU/ml灵敏度的鲎试剂对应。故选用灵敏度为0.125 EU/ml鲎试剂进行正式干扰试验。

2.4. 正式干扰试验

用湛江安度斯生物有限公司和福州新北生化工业有限公司两个厂家的鲎试剂对3批供试品进行正式干扰试验。

制备含有0.25、0.125、0.06和0.03 EU/ml内毒素浓度的1 mg/ml的供试品溶液，设4复管；用BET水制备0.25、0.125、0.06和0.03 EU/ml内毒素溶液，设2复管；并分别设1mg/ml的供试品溶液（A）2复管和阴性对照（NC）2复管，鲎试剂灵敏度为0.125 EU/ml，用镁离子缓冲液复溶。按《中国药典》（四部）2020年版通则1143^[5]进行干扰试验，结果见表5。

鲎试剂批号	溶液名称	内毒素浓度（EU/ml）				A	NC	λ_c，E_t
鲎试剂批号	溶液名称	0.25	0.125	0.06	0.03	A	NC	λ_c，E_t
2211211	BET水	++	++	− −	− −	− −	− −	λ_c=0.125
	A0001	++++	++++	− − − −	− − − −	− −	− −	E_t=0.125
	A0002	++++	++++	− − − −	− − − −	− −	− −	E_t=0.125
	A0003	++++	++++	− − − −	− − − −	− −	− −	E_t=0.125
21030312	BET水	++	+−	− −	− −	− −	− −	λ_c=0.18
	A0001	++++	− − −+	− − − −	− − − −	− −	− −	E_t=0.21
	A0002	++++	− − − −	− − − −	− − − −	− −	− −	E_t=0.25
	A0003	++++	− − − −	− − − −	− − − −	− −	− −	E_t=0.25
注：λc=log⁻¹（∑X_s/2）、E_t= log⁻¹（∑X_t/4）。其中：X_s为BET水的反应终点浓度的对数值；X_t为干扰试验溶液（即3批供试品）的反应终点浓度的对数值^[6]；A0001、A0002、A0003分别为用供试品批号为220501、220502、220503配制而成的溶液。

由表5可知：阴性对照溶液NC、供试品溶液A的所有平行管均为阴性，内毒素溶液系列的结果λc（0.125，0.18）在0.5 λ～2 λ范围内，试验有效。干扰试验系列的结果（E_t）在0.5 λ～2 λ范围内，符合规定。表明供试品用碱性调节剂溶解成4 mg/ml并用BET水稀释，在1 mg/ml及以下浓度对试验无干扰。

2.5. 供试品检查

用0.125 EU/ml灵敏度的鲎试剂，将供试品用本研究建立的方法进行细菌内毒素检查，结果见表6。

鲎试剂批号	供试品批号	B	A	PC	NC
2211211	220501	++	− −	++	− −
	220502	++	− −	++	− −
	220503	++	− −	++	− −
21030312	220501	++	− −	++	− −
	220502	++	− −	++	− −
	220503	++	− −	++	− −
注：A为1 mg/ml喷替酸溶液；B为1 mg/ml喷替酸溶液含有2λ浓度细菌内毒素；PC为含有2λ浓度细菌内毒素的阳性对照。

3. 结果与讨论

本试验对喷替酸原料药细菌内毒素限值进行确定并对其检查方法进行考察。结果表明：喷替酸适合采用《中国药典》（四部）2020年版通则1143^[5]中的凝胶法进行细菌内毒素检查。喷替酸以市售的碱性调节剂溶解并以BET水稀释至4 mg/ml及以下浓度，选用0.125 EU/ml及以上灵敏度的鲎试剂，用市售的镁离子缓冲液复溶后，进行细菌内毒素检查，限值为小于0.125 EU/mg。

　　因我国目前尚无喷替酸原料药检验的国家标准，而在药品的研发中对其质量标准提出了需求，故探索了喷替酸原料药内毒素检查的限值，并对其检查的方法学进行了考察。经过试验摸索，发现用市售的镁离子缓冲液溶解喷替酸并稀释，无法去除其对鲎试剂与内毒素反应的干扰。将喷替酸用市售的碱性调节剂溶解成4 mg/ml，再用BET水稀释至合适浓度，鲎试剂用镁离子缓冲液复溶，则能消除对试验的干扰，方法简便可行，为建立喷替酸及其制剂标准提供了参考。

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[1]	BUCKINGHAM J, MACDONALD F. Anonymous Pentetic Acid. In the Dictionary of Organic Compounds[M]. Sixth Edition. Florida: CRC Press, 1996: 1188.
[2]	U. S. Food and Drug Administration. NDA 21-751 Pentetate zinc trisodium injection [EB/OL]. (2004-08-11)[2023-07-25]. https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2004/021751lbl.pdf.
[3]	药品标准查询数据库. Pentetic Acid[DB/OL].(2008-11-01)[2023-07-25]. https://www.drugfuture.com/Pharmacopoeia/usp 32/pub/data/v32270/usp32nf27s0_m62300.html.
[4]	药品标准查询数据库. Pentetic Acid[DB/OL].(2024-01-06)[2024-02-12]. https://www.drugfuture.com/Pharmacopoeia/USP 2024/download.aspx?filename=Pentetic%20Acid.
[5]	国家药典委员会. 中华人民共和国药典(四部)2020年版[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020: 178-181, 516-520.
[6]	沈娟, 芦佳月, 罗晓茹, 等. 高浓度维生素B₆注射液细菌内毒素检查方法学验证[J]. 药学实践杂志, 2020, 38(1): 67-70.

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Study on bacterial endotoxin limit value and the detection methodological investigation for the active pharmaceutical ingredient of pentetic acid

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202508061

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

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