Study on the hemolysis, allergenicity and local irritancy of Fibrauretine injection

注射用黄藤素（批号：112107，112109，112111，规格：20 mg/瓶，相关单位提供）；氯化钠注射液（批号：23E99A2，规格：100 ml 0.09 g，中国大冢制药有限公司）；鸡蛋白蛋白（Sigma公司）；灭菌注射用水。

电热恒温水浴箱（SHW21-420，湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司），离心机（TD4A，长沙英泰仪器有限公司），万分之一电子天平[XS204，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，紫外可见分光光度计（UV-VIS-T90＋,英国PG公司），恒温鼠兔解剖台（ZH-B-Ⅲ，安徽正华生物仪器设备有限公司），高精度电子秤（HX-T3，惠州市英衡电子科技有限公司），全自动动物窒息器（FSZZ-2A，苏州市冯氏实验动物设备有限公司），固定架及一次性注射器。

普通级新西兰兔，生产许可证号：SCXK（苏）2019-0005，SCXK（苏）2024-0007，合格证编号：202318915，202323397，B202411260126，购自南京市浦口区莱芙养殖场。普通级豚鼠，生产许可证号：SCXK（苏）2019-0005，合格证编号：202325653，购自南京市浦口区莱芙养殖场。动物饲养于阜阳市食品药品检验检测中心实验动物中心，使用许可证号：SYXK（皖）2022-009。

静脉滴注，一日一次，40 mg/次，用0.9%氯化钠注射液100 ml稀释后缓慢滴注，临床最大用量为40 mg溶解到100 ml，最大可稀释倍数按试药的量进行换算为100倍，浓度为0.4 mg/ml， 按1∶50、1∶100、1∶150、1∶200梯度进行试验。

肌内注射，用灭菌注射用水2 ml溶解后，一次20 mg，40～80 mg/d；临床最大用量为20 mg溶解到2 ml，最大浓度按试药的量进行换算为10 mg/ml。

健康兔心脏采血10 ml置清洁烧杯中，搅拌除去纤维蛋白，加入10倍量的0.9%氯化钠注射液，摇匀，1 500 r/min离心15 min，除去上清液，将沉淀后的红细胞按上述方法加入0.9%氯化钠注射液洗涤3次，直至上清液不显红色为止；量取红细胞2 ml加入0.9%氯化钠注射液至100 ml，制成2%兔红细胞悬液。

按照2025年版《中国药典》（四部 通则1148）溶血与凝聚检查法检测，3批供试品各取适量，分别用0.9%氯化钠注射液按1∶50、1∶100、1∶150、1∶200倍溶解制成系列溶液，各浓度下分别取3份，编号，按表1所示依次加入2%兔红细胞混悬液、氯化钠注射液、蒸馏水或供试品溶液，混匀后，立即置（37±0.5）℃的恒温水浴器中进行温育，3 h后观察溶血和凝聚反应。

另取适量3批供试品按照“2.2.2”项下方法对样品进行处理，按表2所示依次加入2%兔红细胞混悬液、氯化钠注射液、蒸馏水或供试品溶液，其中4号和5号管分别为阴性和阳性对照。混匀后，立即置（ 37±0.5）℃的恒温水浴器中温育3 h，管内液体转移至离心管中，1 500 r/min，离心5 min，吸取上清液至比色皿中，以0.9%氯化钠溶液作为空白对照，照2025年版《中国药典》（四部 通则4414）药包材溶血检查法，于545 nm波长处测定吸光度，其中，溶血率小于5%表示无溶血发生。

普通级健康豚鼠30只，分成5组，鸡蛋白蛋白（阳性对照组）、0.9%氯化钠注射液（阴性对照组）、供试品3组（黄藤素20 mg/ml），每组6只，雌雄各半，雌性未孕，体重范围250~350 g。按照腹腔注射给药致敏，致敏量为0.5 ml/只，静脉注射给药激发，激发量为1 ml/只；每隔1天注射1次，连续注射3次，分别为第1、3、5 d，激发时间为末次致敏后的第14 d（首次激发），第21 d，分别取3只动物，雌雄兼顾进行激发，每组首次激发后剩余雌/雄1只动物，则单笼饲养。激发后立刻进行3 h观察，包括其症状的出现以及消失时间，判断过敏反应发生程度，综合评价过敏反应情况。

取新西兰兔12只（雌雄各半），分为3组，每组4只，每只兔自身左右侧互为对照,根据人体临床建议最大用量40 mg/d，折算兔的临床等效剂量为0.216 mg/kg,因此左耳静脉注射药物浓度为0.40 mg/ml、体积为1.25 ml的供试品溶液，右耳注射等量的0.9%氯化钠注射液，给药速度不大于1 ml/min，每天1次，连续给药7 d，详细观察并记录每次注射给药前后注射部位的反应、动物的体态、行为等，停药后连续观察14 d内每天给药注射部位的反应、动物的体态、行为等。 最后一次给药后72 h及14 d，每组各取2只共6只放入全自动动物窒息器内进行安乐死，剖取包含注射进针部位及耳缘静脉的整个耳组织固定于12%的福尔马林溶液中，经过脱水、包埋、染色和光镜检查。按表3进行评分、判断。

新西兰兔9只（雌兔6只雄兔3只）,分为3组，每组3只（雌兔2只雄兔1只），每只左侧股四头肌注射1 ml浓度为10 mg/ml供试液，右侧股四头肌注射等量的0.9%氯化钠注射液，每天注射1次，连续给药7 d，详细观察每次注射给药前后注射部位的反应、动物的体态、行为等状态，最后一次给药72 h及14 d后，分别取6只（每组随机选取2只）、3只（每组1只）放入全自动动物窒息器内安乐死，剖检动物进行病理学检查。根据《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》中的肌肉刺激反应分级标准和等级，计算平均值并判定刺激等级，如各股四头肌反应级的最高与最低之差大于2，则另取动物重新试验。

肉眼观察法：3批供试品在1∶50的稀释倍数时均出现溶血反应，从1∶100到1∶200的稀释倍数中加入供试品的1、2号试管内红细胞全部下沉，上清液无色澄明，和3号（阴性对照）试管观察结果相同，判断无溶血和凝聚发生。

分光光度法：批号112109的3号供试品管、批号112111的2号供试品管的1∶100稀释倍数出现溶血现象（溶血率>5%）。为进一步证实该结果，另取上述两个批号的5瓶复试，发现批号112109无溶血现象，最大溶血率为4.9%，而批号121111有两瓶样品均出现溶血现象，溶血率分别是5.1%、5.9%，分光光度法检测结果表明：3个批次的供试品中不但存在溶血性的差异，也存在批次的差异。结果见表4。

阳性对照组动物在第14 d（3只）、第21 d（3只）激发给药后30 min内均出现过敏反应，如步态不稳、痉挛、旋转、死亡等强阳性到极强阳性强度的过敏反应并全部死亡，阴性对照组和供试品组在2次激发注射后均未出现过敏相关的异常症状。该结果表明，供试品不引起豚鼠过敏反应。

连续给药7 d及停药后14 d期间，肉眼观察各例兔左耳即供试品组侧，批号112109供试品组和批号112111供试品组分别有出现血管轻度充血、轻微水肿的现象；在14 d恢复期结束时各例兔左耳完全恢复。

连续给药7 d结束后72 h，批号112109供试品组和批号112111供试品组的兔耳分别有血管内皮细胞损伤及周围组织水肿、充血的现象。连续给药7 d结束后14 d，各例兔耳血管内皮及血管壁完整，周围组织正常，水肿消失。

观察结果表明，浓度0.40 mg/ml的供试品溶液可引起家兔血管短暂的刺激性反应，表现为给药期间局部充血、水肿及72 h内的血栓形成，但停药14 d后组织可以完全修复，根据可逆性病理改变特征，判定有轻度至中度血管刺激性。结果见图1。

停药72 h及14 d后所剖检的动物病理学检查，供试品侧注射部位无明显变化，反应级为0，表明浓度为10 mg/ml供试品对兔股四头肌没有刺激作用。

注射用黄藤素是由防己科植物黄藤的茎中提取得到的纯天然生物碱黄藤素制成，属于黄藤素注射液等成方制剂改变剂型的新药，是非口服途径给药的改良型药物，与原有制剂比较，此类药物处方工艺和/或给药途径可能发生改变，需开展相应的制剂安全性研究^[10]。根据溶血性、过敏性和局部刺激性试验的结果发现，注射用黄藤素不会对豚鼠引起过敏反应，对兔的股四头肌无刺激作用，具有一定的溶血性，兔血管刺激性试验显示有轻度至中度血管刺激性。

溶血性试验中，肉眼观察法与分光光度法检测结果有一定的偏差，肉眼观察法在溶血的临界值处主观判断上会出现一定的误差，分光光度法测量能从客观上更加准确的定量判断是否具有溶血性。供试品中溶血现象的产生，可能与药品的辅料、生物碱含量或者精制、冻干、结晶等因素导致的样品均一性差异有关。分析药品的生产环节，排除辅料的差异，并进一步检测供试品的生物碱含量，分别为2.51%、2.39%、2.63%，三批次之间的差异不大，基本可以排除生物碱含量的影响；供试品中黄藤素按盐酸巴马汀（C₂₁H₂₁NO₄·HCl）计分别为98.64%、99.16%、98.33%，进一步排除含量均一性的影响；通过对供试品进行X射线衍射分析，发现同一批次的样品中不同晶型的占比有一定的差别，其中无定形结晶占比增加。通过对生产工艺流程进行梳理并查看生产记录发现：一是后放入冻干机的管制瓶样品中无定形结晶的含量大于先放入的样品；二是2批有溶血现象的供试品与1批未发现溶血现象的供试品预冻至−40℃时的降温速率不同。针对上述情况进一步分析原因，发现温度变化对黄藤素晶型的形成影响较大，晶型不同，溶出效果不同，这可能是造成同一批次样品溶血性试验有不同结果的主要原因。制备工艺不成熟，将会导致不同批次的样品质量（含量、纯度、杂质、晶型等）不一致，进而影响安全性评价实验数据的准确、可靠^[11]。后续生产过程中应微调冻干曲线，减小升温速率，同时在达到需要的阶段性温度后，增加保温时间，减少无定形结晶的生成，严格检查项目以保证产品性质的均一性。兔血管刺激性试验中虽然发现72 h病理切片显示血管栓塞及内皮损伤，但14 d后组织恢复正常，表明该损伤属于可逆性病理改变，符合刺激性反应特征。后续工作中应进一步考察供试品的滴注速度、药物浓度等参数的影响，为上市后的药品安全评价提供参考依据。

目前，现行2025版《中国药典》一部只收载了两种中药注射粉针剂，国家对该剂型安全性是非常谨慎的。即使是已经上市多年、临床证明安全性很高的中药注射剂，也偶有不良事件发生，因此对相关注射剂安全性的研究始终保持着较高的热度^[12-13]。动物安全性实验是确保药物安全的第一道防线，能够对药物临床实验的设计提供重要的参考依据，也是保证药品质量，保障人民群众用药安全的基本检验。