Isolation of Rhizobacteria from Crocus Sativus L.Rhizosphere and Their Effects on Host-Growth Promotion

供试菌株来源于前期从番红花根际分离，与拟南芥共培养筛选得到的根际促生菌SR383，田间实验使用的番红花购自上海市崇明区番红花基地。

葡萄糖、1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶（l-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）活性测定培养基（上海源叶生物科技有限公司）；琼脂（北京康倍斯科技有限公司）；蛋白胨（杭州茉钡特生物科技有限公司）；氯化钠（天津市永大化学试剂有限公司）；酵母浸膏（杭州百思生物技术有限公司）；高氯酸、次氯酸钠（Greagent）；氯化铁、氯化钡、苯酚钠（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；无机磷培养基、硅酸盐培养基、阿须贝氏培养基、铬天青培养基（青岛海博生物技术有限公司）；总超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒、酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）活性检测试剂盒、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性检测试剂盒（杭州碧云天生物技术股份有限公司）；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性检测试剂盒、过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性检测试剂盒、3，5-二硝基水杨酸（北京博奥森生物技术有限公司）；氢氧化钠、氯化钡、盐酸、甲苯、过氧化氢、高锰酸钾（国药集团化学试剂有限公司）；色氨酸、三苯基四氮唑（Adamas）。

溶菌肉汤（Lysogeny broth，LB）培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸膏5.0 g，氯化钠 10.0 g，琼脂15.0 g。液体培养基配制不加入琼脂。上述培养基溶于1 L纯水中，在121℃下高压灭菌15 min。固体培养基分装至90 mm培养皿中，冷却后备用。马铃薯葡萄糖琼脂（Potato dextrose agar，PDA）培养基：去皮马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15 g，纯水1 L，自然pH。配置方法同上。Salkowski试剂：35% HClO₄ 50 ml，0.5 mol/L FeCl₃ 1 ml。

万分之一电子天平（上海天美天平仪器有限公司）；电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司）；细菌培养箱（上海龙跃仪器设备有限公司）；立式恒温摇床（上海牟测仪器科技有限公司）；酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；台式高速冷冻离心机（Eppendorf）；去离子纯水机（上海和泰仪器有限公司）；pH计（梅特勒-托利多国际贸易）。

菌株SR383的促生特性测定如下：IAA合成采用色氨酸-LB液体培养法，离心取上清加Salkowski试剂显色，540 nm比色定量^[3]；赤霉素（gibberellin，GA）检测通过浓硫酸显色反应结合412 nm吸光度测定。溶磷、溶钾能力分别通过无机磷/硅酸盐培养基透明圈法观测^[4]，固氮能力依据阿须贝氏培养基生长情况评估^[5]。ACC活性测试参照关永贺等方法^[6]，通过OD₆₀₀值比较菌株在ACC为唯一氮源时的生长差异。

采用细菌基因组DNA提取试剂盒 [天根生化科技（北京）有限公司] 提取细菌DNA^[7]。采用16S rDNA的通用引物27F（5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'）和149R（5'-TAC GGC ATC CTT GTT ACG ACT T-3'）进行特异性扩增^[8]。PCR反应体系为50 μl，包括2 μl模板DNA、上下游引物各2 μl、25 μl 2×Taq Mix和21 μl去离子水。PCR反应条件：95 °C 5 min，94 °C 40 s，52 °C 50 s，72 °C 1 min，35 个循环，72 °C 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶（150 V，20 min），检测合格后送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。所得序列数据应用NCBI BLAST工具进行同源性分析，并使用MEGA 11软件和邻接法进行系统发育分析。

实验在上海市海军军医大学实验农场（31°3′N，121°5′E）开展，年均温14～21℃，年均降水量1 275 mm，无霜期230～250天。试验地自2019年休耕，土壤初始pH 5.23，有机质20.16 g/kg，碱解氮208.65 mg/kg，有效磷23.57 mg/kg，有效钾868.36 mg/kg。设置SR383接种组（50个消毒球茎浸菌12 h，菌液浓度为1×10⁸ CFU/ml）与无菌水对照组。2021年11月定植于15个地块（1 m×1.5 m，行距0.2 m，株距0.1 m，深度0.08 m），常规管理越冬。2022年3月采集根际土及植株样品：根际土过2 mm筛后4°C保存；植株分器官测定鲜重和长度，部分组织-80 °C冻存用于生理分析。子球茎于3～4月形成，同步记录生长参数。

除去番红花球茎膜质包被并洗净，称取约 0.1 g 新鲜番红花球茎组织，加入 1 ml 磷酸缓冲液进行冰浴匀浆；8 000 r/min, 4℃离心 10 min，取上清，置于冰上待测。按照试剂盒说明书进行MDA含量和SOD、POD、CAT活性的测定^[9]。

土壤细菌数量（Total bacterial count，TBC）和真菌数量（Total fungal count，TFC）采用稀释涂布平板法。称取相当于5.0 g干重土的新鲜土壤，加入含有45 ml无菌水和玻璃珠的三角瓶内，30℃，4 150 r/min震荡30 min。取土壤悬液10倍梯度稀释至10⁻⁶，吸取100 μl涂布相应的平板。置30℃培养箱中培养，观察计数。结果以每克干土所含菌数量（CFU/g）表示。细菌培养采用LB培养基培养，真菌培养采用PDA培养基培养。

土壤微生物生物量碳（Microbial biomass carbon, MBC）、氮（Microbial biomass nitrogen, MBN）采用氯仿熏蒸-硫酸钾浸提法测定^[10]。具体流程：取25.0 g土样经氯仿熏蒸24 h（25℃），抽气去除残留氯仿。熏蒸组与未熏蒸组分别加入10 mg新鲜土壤，调节含水量至田间持水量55%，于25℃黑暗培养10 d。培养后，NaOH吸收液经盐酸滴定法测定CO₂释放量，计算MBC；土样经100 ml 0.5 mol/L KCl浸提，滤液通过靛酚蓝比色法（NH₄⁺）和代氏合金还原蒸馏法（NO₃⁻）测定氮含量，结合熏蒸与未熏蒸组差值计算MBN。空白对照同步处理以校正背景值。

土壤脲酶（SUE）活性采用靛酚蓝比色法活性测定^[11]。土壤蔗糖酶（Soil sucrase，SSC）活性测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定^[12]。土壤脱氢酶（Soil dehydrogenase，SDHA）活性采用氯化三苯基四氮唑比色法测定^[13]。土壤过氧化氢酶（Soil catalase，SCAT）活性测定采用高锰酸钾滴定法^[14]。土壤酸性磷酸酶（Soil acid phosphatase，SACP）^[15]和土壤碱性磷酸酶（Soil alkaline phosphatase，SALP）^[16]按照试剂盒说明书上的步骤进行。

如表1所示，菌株SR383具有产生IAA和GA的能力，IAA的产率为6.18 μg/ mg，GA的产率为2.01 μg/mg。菌株SR383同时表现出固氮、溶磷、解钾和分解ACC的能力，但并未表现出产生铁载体的能力。

基于16S rDNA序列的BLAST比对显示，SR383与嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia McS10（KY078806）相似度达99.7%，系统发育树显示Stenotrophomonas maltophilia McS10（KY078806）形成支持率93%的进化枝。因此，将菌株 SR383 鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophili）（图1）。

与未接种处理相比（图2A B），接种根际细菌SR383促进了番红花球茎鲜重的增加，鲜重相对增幅为40.53%。另外，接种SR383分离株的叶片长度有增加，叶长相对增幅为70.57%。番红花的抗氧化活性和MDA含量如图2 C-F所示，根际细菌SR383的MDA含量显著降低，降幅达到21.00%。但菌株的CAT活性显著提高，增幅为104.85%。值得注意的是，SR383处理时CAT活性最高。分离株SR383的POD活性提高了34.15%。此外，SR383分离株的SOD活性升高幅度在66.40%。

如图3所示，SR383接种的番红花根际土壤的TBC显著升高，增幅为846.07%,然而TFC却显著降低了84.64%。SR383接种的番红花根际土壤的MBC同样也有着明显的升高，增幅为11.54%。SR383接种的土壤的MBN亦有增加，增幅为178.42%。

如图4所示，菌株SR383显著影响了土壤酶活性。其中，其对土壤碳、氮循环相关酶的提升作用最为突出：SR383处理的SSC和SUE活性较对照组分别提高了55.62%和55.72%，表明其能有效促进土壤碳源和氮素的转化。在反映微生物活性和氧化应激的指标上，SR383对SDHA活性的提升有限（6.98%），但使SCAT活性大幅提高了115.41%，显示出其对缓解土壤过氧化胁迫的潜在作用。此外，SR383对土壤磷酸酶也有一定促进效果，使SACP和SALP活性分别提高10.72%和12.48%，有助于土壤有机磷的矿化。

PGPR是与植物协同进化的共生微生物，通过拮抗或协同作用调节土壤微环境，其促生机制包括直接作用（如养分活化、激素合成）和间接作用（如抗逆诱导、病害抑制）^[17]。番红花作为三倍体不育植物，依赖球茎无性繁殖，其生长发育与土壤环境密切相关^[18]。前人研究从番红花根际分离了多种PGPR（如产IAA、铁载体及溶磷菌株），并验证了其田间促生效果，但关于PGPR改善土壤条件的作用机制尚未深入解析^[19-21]。

PGPR通过分泌IAA、GA等植物激素及ACC脱氨酶调控植物生长，同时通过固氮、溶磷、产铁载体等提高养分有效性^[22-23]。Ambardar等分离的6株菌中，6株产IAA，3株产铁载体，2株溶磷；Kour等鉴定的17株菌均具IAA和铁载体合成能力；Magotra等获得的13株菌中，8株产IAA，12株产铁载体，6株溶磷^[19-21]。本研究发现SR383菌株具有独特促生特性，表明植物与PGPR互作受生物因素（如微生物群落、发育阶段）和非生物因素（如土壤组成、气候）共同调控。

田间试验显示，SR383显著增加番红花球茎鲜重及叶片长度，与文献报道的PGPR提升生物量趋势一致^[24]。环境胁迫诱导植物活性氧（ROS）积累，造成膜脂过氧化（MDA含量升高），而PGPR可通过上调抗氧化酶（POD、CAT、SOD）活性缓解氧化损伤。例如，Serratia odorifera增强干旱胁迫下抗氧化酶活性^[25]，Pantoea agglomerans和Pseudomonas fragi提升盐胁迫下的CAT和POD活性^[26]。本研究中，SR383处理降低MDA含量并激活抗氧化酶系统，证实PGPR通过调节氧化平衡增强植物抗逆性。

PGPR定殖效率受土著微生物竞争抑制^[27]，但其仍可通过调控土壤微生物群落与酶活性改善土壤功能。本研究发现，SR383接种显著提高土壤细菌总数、微生物生物量碳/氮及酶活性水平。微生物生物量碳增加可能促进碳矿化，而土壤酶（如脲酶、磷酸酶）活性增强直接反映土壤肥力提升^[14,28]，SR383可能通过“植物-微生物-土壤”协同机制实现促生效应。

综上，本研究揭示了SR383菌株通过多重促生途径（激素调控、养分活化、抗逆诱导）及土壤改良功能促进番红花生长，为其作为生物肥料替代化学投入品提供理论依据。