Pharmacokinetic Study of Flumazenil Sublingual Spray in Beagle Dogs

HUA Junjie; ZHU Min; ZHANG Yingnan; LU Guangzhao; ZHANG He

doi:10.12206/j.issn.2097-2024.202503042

Objective To investigate the pharmacokinetics of flumazenil sublingual spray in Beagle dogs. Methods Twelve Beagle dogs were grouped in a two-period, two-sequence crossover study design, receiving intravenous injection or sublingual spray administration. Blood samples （2 ml） were collected from the leg vein at 0.16, 0.33, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0, 6.0, and 8.0 h post-dosing. The plasma concentration of flumazenil was quantified by liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） with an internal standard method, and key pharmacokinetic parameters were calculated. Results The t_max values for flumazenil injection and sublingual spray were 0.17 h and （0.28±0.10） h, respectively; C_max values were （8.14±0.81） ng/ml and （10.41±1.72） ng/ml; and AUC_0–∞ values were （6.90±0.99） ng·h/ml and （10.97±1.68） ng·h/ml. The bioavailability of the sublingual spray was 80.79±0.14%. Conclusion Flumazenil sublingual spray demonstrates rapid absorption and high bioavailability in Beagle dogs.

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氟马西尼是一种苯二氮䓬（benzodiazepines，BZDs）受体的竞争性拮抗剂，通过竞争性结合γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）-A受体上的苯二氮䓬结合位点，抑制苯二氮䓬类药物的调节作用，从而逆转其镇静和抗焦虑效应，临床可用于快速逆转苯二氮䓬类药物所致的中枢镇静作用，快速降低机体对苯二氮卓类药物的耐受性和依赖性，提供安全快速的苯二氮卓类药物解毒，帮助患者快速恢复清醒状态清醒^[1-3]。此外，针对中枢性嗜睡疾病，氟马西尼已证实能够改善患者的心理运动警觉性和主观警觉性，有效减轻嗜睡症状^[4-6]。

氟马西尼在人体内的代谢受年龄影响较小，主要受首过效应影响，口服给药时，其生物利用度仅为15%～17%，90%以上氟马西尼经肾脏代谢为无活性产物后排出^[7]。临床上以静脉注射为氟马西尼主要给药方式，须有专业人员操作。为了改善其用药便捷性和患者依从性，通过制剂设计可规避首过效应，目前氟马西尼的鼻腔滴剂、可植入片剂和舌下片等制剂已经过测试或正在开发中^[6,8-11]。其中，舌下给药方式通过舌下黏膜丰富的血管直接吸收进入血液循环，绕过肝脏首过效应，生物利用度高，且在重复给药的过程中能够规避静脉注射的侵入性操作，具有良好的应用前景。课题组前期已经开展氟马西尼舌下片的药动学研究^[11]，本研究进一步探索了氟马西尼舌下喷雾剂在比格犬体内的主要药动学参数，期望能为临床应用提供数据支撑。

1. 材料和方法

1.1. 材料

1.1.1. 实验动物

清洁级比格犬，雄性，体重7~9 kg, 均单笼饲养于苏州莱奥生物技术有限公司实验动物中心，动物许可证号：SCXK（京）2021-0002，所有动物自由进食饮水，动物房设定室温18～26℃，湿度40～70%，光照12 h明暗交替。

1.1.2. 药品与试剂

氟马西尼注射液（5 ml：0.5mg，批号：H20063821，浙江仙琚制药股份有限公司）；氟马西尼舌下喷雾剂（5 ml：10 mg，批号：20230113，实验室自制）；氟马西尼对照品（100 mg，中国食品药品检定研究院）；二甲基亚砜DMSO（色谱纯，Sigma-Aldrich公司）；甲苯磺丁脲（色谱纯，Sigma-Aldrich公司）；乙腈（色谱纯，Sigma-Aldrich公司）；甲酸铵（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；去离子水实验室自制。

1.1.3. 主要仪器

高效液相色谱仪（LC-20AD，日本岛津公司）；质谱仪（QTRAP，美国SCIEX公司）；十万分之一天平（SECURA125-1CN，德国赛多利斯公司）；色谱柱（XSelect HSS T3，美国Waters公司）；冷冻离心机（Velocity 18R，英国Dynamica公司）；超纯水机（Barnstead，美国Thermo Fisher公司）；超声波清洗器（Simp liamp，Life technologies Company）；涡旋振荡器（VORTEX-6，海门市其林贝尔仪器有限公司）。

1.2. 方法

1.2.1. 溶液配制

对照品溶液的配制：精密称取氟马西尼10 mg置于10 ml 量瓶中，加入5 ml DMSO，涡旋超声至充分溶解，用DMSO定容，配制得1.0 mg/ml的氟马西尼储备液。用70%乙腈水溶液按比例逐级稀释储备液，配制得浓度为10、20、40、200、1 000、2 000、4 000 ng/ml的系列对照品溶液，存于4℃冰箱备用。

内标溶液的配制：精密称取10 mg甲苯磺丁脲于10 ml量瓶中，加入5 ml DMSO，涡旋超声至充分溶解，用DMSO定容，配制得1.0 mg/ml的甲苯磺丁脲储备液。用乙腈将甲苯磺丁脲储备液稀释5 000倍，配成200 ng/ml的内标溶液，存于4℃冰箱备用。

1.2.2. 血浆样品处理方法

取100 μl血浆样品到EP管中，加入600 μl内标溶液（200 ng/ml甲苯磺丁脲的乙腈溶液）。涡旋混匀1 min，在13 000 r/min、4℃条件下离心10 min，取上清液用30%的乙腈溶液1∶1稀释，待测。

1.2.3. LC-MS/MS检测条件^[11]

色谱条件：色谱柱XSelect HSS T3（2.1 mm×50 mm，2.5 μm），流速0.6 ml/min，柱温15℃，进样量8 μl，流动相1 mmol/L甲酸铵水溶液为A相，乙腈为B相。梯度洗脱：0.01～1.30 min，30%B；1.30～1.80 min，30%~95%B；1.80～1.81 min，95%B；1.81～2.20 min，30%B。

质谱条件：电喷雾电离源（ESI），正离子模式下多反应监测（MRM）扫描，喷雾电压5.5 kV，源温度500℃，雾化气为60 psi，辅助加热气为60 psi，气帘气为40 psi，离子对、去簇电压、碰撞室出口电压及碰撞能量等参数见表1。

药物母离子子离子去簇电压（U/V）碰撞室出口电压（U/V）碰撞能量（U/V）

氟马西尼 304.2 257.9 140 15 25
甲苯磺丁脲 271 74.2 70 15 22

1.2.4. 比格犬体内药动学研究

实验动物分组：实验采用双周期双交叉实验设计方案。将12只雄性比格犬，随机编号，分组实验。受试动物实验前禁食至少12 h，自由饮水，两周期间洗净期为1周。

给药方法与取样：氟马西尼注射液，单剂量静脉注射，每次每只比格犬1 ml（含主药成分0.1 mg）。氟马西尼舌下喷雾剂，单剂量舌下喷雾给药，每次每只比格犬1揿（100 μl，含主药成分0.2 mg）。于给药后0.16、0.33、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0 h由腿静脉取血2 ml，置于肝素钠采血管中，以12 000 r/min条件离心10 min，分离血浆，置于-2℃冰箱保存待测。

血药浓度测定：运用LC-MS/MS内标法定量测定每只比格犬各采血时间点血药浓度，利用WinNonlin 7.0 药动学软件对所测数据进行非房室模型分析。

3. 讨论

为实现氟马西尼对苯二氮卓类药物的拮抗作用并促使患者恢复清醒状态，其快速起效至关重要。注射剂、舌下喷雾剂、舌下片等剂型均可以满足氟马西尼的快速起效需求。

本课题运用（LC-MS/MS）内标法定量测定比格犬血浆中氟马西尼浓度，对自制的氟马西尼舌下喷雾剂在比格犬体内药物代谢动力学进行研究，并计算主要药动学参数。比较校正后药动学参数可见，舌下喷雾剂的AUC_0-∞、C_max均显著高于注射剂（0.1 mg）（P<0.01），结合目前临床上注射液促醒起始剂量0.1 mg，可知喷雾剂单揿即可达药物起效剂量；且MRT_0-∞显著长于注射剂（P<0.01），表明药物在体内滞留时间更长，作用更为长效。

前期氟马西尼舌下片的研究显示，舌下片需15 min完成崩解与溶出，经舌下黏膜吸收后，在比格犬体内药物达峰时间约35 min，生物利用度约52.68%^[10]。较长的达峰时间可能与药片在舌下的停留吸收有关，并且停留时间长可能会导致部分药物进入胃肠道引起首过效应，使其生物利用度不及舌下喷雾剂。相比之下，舌下喷雾剂以微滴形式直接接触舌下黏膜，无崩解过程，药物被黏膜快速吸收，可将达峰时间缩短至17 min，使氟马西尼起效时间提前，生物利用度提高至80.79%。说明氟马西尼舌下喷雾剂有较好的临床应用潜力。

目前，氟马西尼上市剂型为注射剂，需静脉注射（0.1～0.2 mg的小剂量递增），用于苯二氮卓类药物中毒解救、昏迷诊断及术后过度镇静逆转。但由于氟马西尼在肝脏快速消除，半衰期时间较短，导致其持续作用时间有限；为维持拮抗作用，在治疗过程中需根据病情进展及患者机体反应多次给药^[12-13]，存在给药难度大、安全性低、患者依从性差等问题。

相较而言，本研究开发的氟马西尼舌下喷雾剂具有避免首过效应、起效快速、使用便捷舒适等特点，特别在多剂量给药、群体给药方面具备注射剂无法比拟的优势，且更适用于急救、吞咽困难或昏迷患者，值得进一步研发推广。

此外，研究显示，单次口服剂量高达600 mg或静脉推注高达100 mg时，氟马西尼在健康志愿者中耐受良好，没有显著的药理效应^[14]。口服氟马西尼安全窗相对较宽，但舌下喷雾剂起效迅速，若患者重复给药或操作失误会导致剂量增加，需严格规范给药剂量和间隔以保障安全，在安全性方面需要进一步研究。

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参数	静脉给药（0.1 mg）	舌下喷雾给药（0.2 mg）	P
t_1/2（h）	0.53±0.08	0.59±0.20
T_max（h）	0.17±0.00	0.28±0.10	<0.01
C_max（ng/ml）	8.14±0.81	10.41±1.72	<0.01
AUC_0-t（ng·h /ml）	6.70±0.97	10.73±1.65	<0.01
AUC_0-∞（ng·h /ml）	6.90±0.99	10.97±1.68	<0.01
MRT_0-∞（h）	0.68±0.09	0.94±0.18	<0.01
F（%）		80.79±0.14

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Pharmacokinetic Study of Flumazenil Sublingual Spray in Beagle Dogs

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202503042

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

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