Study on quality standards of Liuwei Runfu oil recipe

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；BSA822-CW型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；CQ-250A-DST型超声波清洗仪（上海跃进医疗器械有限公司）；SHZ- D（Ⅲ）型循环水式真空泵（郑州博科设备有限公司）；RV-10型旋转蒸发仪（德国IKA公司）； BD- Ⅱ型多功能紫外分析仪（北京启航博达科技有限公司）；HWS28型电热恒温水浴锅（上海一恒科学实验有限公司）。

六味润肤油摩方（岳阳医院制剂室，批号分别为 20230801，20230802，20230803）；洋川芎内酯A对照品（货号为ST10580220，含量≥95.0%），购于上海诗丹德标准技术服务有限公司；藁本内酯对照品 （批号为111737-202311），亚油酸对照品（批号为111622-202105，含量≥98.0%），甘油三油酸酯对照品（批号为121254-202105，含量≥99.8%），甘草苷对照品（批号为111610-202209，含量≥95.0%）均购于中国食品药品检定研究院；硅胶G薄层板（山东省烟台江友硅胶开发有限公司）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

火麻仁鉴别：取六味润肤油摩方40 ml，加甲醇40 ml，振摇5 min，静置30 min，取甲醇层溶液，回流浓缩后定容至2 ml，作为供试品溶液；按六味润肤油摩方处方及工艺，制备不含火麻仁的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液；另取亚油酸对照品，加甲醇制成每1 ml含20 μl的溶液，作为对照品溶液。按照TLC法（通则 0502）试验，吸取上述溶液各3 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（3∶0.3∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1。

川芎、当归鉴别：供试品溶液制备方法同前；按六味润肤油摩方处方及工艺，制备不含川芎、当归的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液；另取藁本内酯对照品，加甲醇制成每1 ml含50 μl的溶液，作为对照品溶液。按照TLC法（通则 0502）试验，吸取上述溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯（37∶3）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，斑点清晰，阴性对照无干扰。详见图2。

薏苡仁鉴别：供试品溶液制备方法同前；按六味润肤油摩方处方及工艺，制备不含薏苡仁的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液；另取甘油三油酸酯对照品，加甲醇制成每1 ml含50 μl的溶液，作为对照品溶液。按照TLC法（通则 0502）试验，吸取上述溶液各 5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙醚-冰醋酸（83:17:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，斑点清晰，阴性对照无干扰。详见图3。

甘草鉴别：供试品溶液制备方法同前；按六味润肤油摩方处方及工艺，制备不含甘草的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液；另取甘草苷对照品，加甲醇制成每1 ml含20 μl的溶液，作为对照品溶液。按照TLC法（通则 0502）试验，吸取上述溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，斑点清晰，阴性对照无干扰。详见图4。

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB－C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相: 0.1%磷酸水溶液（A）-甲醇（B），洗脱程序见表1；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；检测波长： 210 nm；进样量：10 μl。

（1）对照品溶液：取洋川芎内酯A、藁本内酯、亚油酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，配制成浓度分别为2.000、0.220、0.451 mg/ml的混合对照品溶液。

（2）供试品溶液：取样品（批号20230801）5 ml，按1:1比例加甲醇混合，振摇5 min后静置30 min，取上清甲醇层，即得供试品溶液。

（3）阴性样品溶液：按六味润肤油摩方处方及工艺，制备缺火麻仁、川芎、当归的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

取供试品溶液、对照品溶液与阴性对照品溶液各10 μl，按2.2.1项下色谱条件进样测定。结果理论板数符合要求，基线分离良好；阴性对照品溶液在与对照品溶液色谱保留时间相同处无干扰峰，表明专属性良好。详见图5。

以2.2.2项下对照品溶液为母液，按不同比例进行稀释，制备五份不同浓度的混合对照品溶液。其中，洋川芎内酯A的浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0、30.0 μg/ml；藁本内酯的浓度分别为0.28、0.55、1.10、2.20、3.30 μg/ml；亚油酸的浓度分别为0.56、1.13、2.26、4.51、6.77 μg/ml。按2.2.1项下色谱条件进样测定，并记录峰面积。以对照品浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得各组分线性方程、相关系数及线性范围。结果见表2。实验结果表明，各成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。

精密吸取2.2.2项下混合对照品溶液10 µl，按2.2.1项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积，计算RSD值，实验数据列于表3。结果表明仪器的精密度良好。

按2.2.3项下的方法分别制备6份供试品溶液，分别进样10 µl，记录洋川芎内酯A、藁本内酯、亚油酸的峰面积，计算RSD值。结果见表4。结果表明方法重复性良好。

取2.2.2项下方法配制供试品溶液，分别于室温放置0、4、8、12、16和24 h。按2.2.1项下色谱条件进样10 µl，测定峰面积，计算RSD值。实验数据列于表5，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

精密量取已知指标成分含量的样品（批号20230801）1ml。在线性范围内配置洋川芎内酯A（24.00 μg/ml）、藁本内酯（0.30 μg/ml）和亚油酸（0.58 μg/ml）混合对照品甲醇溶液。上述两者按1∶1比例混合，0.45 μm微孔滤膜过滤备用。重复上述操作，制备其余5份样品。按2.2.1项下色谱条件测定含量并计算，数据列于表6。根据计算结果，回收率控制在95%~105%之间，RSD值不超过3%。结果表明本含测方法回收率良好。

取3批六味润肤油摩方样品（批号20230801、20230802、20230803），按“2.2.3”项下方法制备供试样品溶液，分别按“2.2.1”项下色谱条件测定洋川芎内酯A、藁本内酯、亚油酸的含量，实验数据列于表7。结果显示，该工艺准确可靠，可行性好，可用于工业化生产。

六味润肤油摩方是一种基于中医“血虚风燥”理论的外用方剂，主要用于治疗特应性皮炎。本实验针对六味润肤油摩方中五种药材进行薄层鉴别，主要参考2020年版《中华人民共和国药典》（一部）的方法^[4]。针对方中的君药火麻仁、当归，臣药川芎，佐药薏苡仁，使药甘草，选取药典上的有效成分进行鉴别，包括亚油酸、藁本内酯^[5]、甘油三油酸酯和甘草苷。以上鉴别，可操作性强，重复性好，斑点清晰易于识别，阴性对照无干扰。

六味润肤油摩方以大豆油浸渍制备，且方中有种仁类药物，所以该制剂中以油脂类成分为主。对于油脂类药效成分的含量测定，《中国药典》（2020年版）^[4]标明的测定方法中，主要采用气相色谱法。为了测定方中主要成分含量，本实验采用高效液相色谱法^[6-8]。采用DAD检测器进行含量测定，结果发现主要成分的分离度均大于1.5，理论塔板数超过5 000，且相似度大于0.9，相较药典方法更加简便易行，更适合该方中主要成分的分离鉴定。经实验，分别采用DAD检测器254、230和210 nm进行检测，发现3种主要标准物质成分能够在210 nm下被测定，故本实验采用单波长同时检测3种主要物质，从而简便了含量测定方法。

本实验建立了六味润肤油摩方5种中药TLC鉴别及3 种有效成分的含量测定方法，实验方法简便可行，灵敏度高，重现性好，可用于六味润肤油摩方的质量控制。从而为六味油摩方在临床上规范化使用，提供质量标准检测方法。现有研究已发现油脂类成分有治疗特应性皮炎的作用^[9-10]，后续我们将进一步探索该制剂中主要活性成分。