Study on the treatment of cerebral infarction with Chinese medicine Shenmajingfu granule by network pharmacology

参麻颈复颗粒共由十二味中药组成，本研究利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP数据库） ^[8]、中药百科全书数据库（ETCM数据库）^[9]、中医药资料库检索参麻颈复颗粒中组成中药的化学成分，TCMSP 数据库没有收录中药天麻和首乌藤，因此天麻的化学成分从ETCM数据库检索，首乌藤的化学成分从中医药资料库数据库检索^[10-11]，鉴于不同数据库中化学成分名称可能不同，因此将检索的化学成分根据其CAS 匹配到 TCMSP，找到该化学成分并获取其作用靶点。其余十味药通过TCMSP查找并导出用于筛选活性成分的相应数据，根据参数的口服生物利用度( oral bioavailability, OB) 和类药性( drug-likeness, DL)^[12]，以OB≥30%且DL ≥0.18作为条件筛选出活性成分，再利用TCMSP，关联相应的靶点，得到潜在靶点蛋白，并通过UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）^[13]匹配靶点蛋白所对应的基因。

将参麻颈复颗粒的活性成分及潜在靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建参麻颈复颗粒的活性成分-预测靶点网络。

基于OMIM数据库^[14]检索脑梗死相关靶蛋白基因，以脑梗死（cerebral infarction）和缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke）为关键词进行靶标检索，所有靶标均通过UniProt数据库获取其UniProt ID信息。

将OMIM中收集到的与脑梗死相关的所有蛋白质，导入STRING数据库，导出分值>0.7的高置信度蛋白相互作用数据，用Cytoscape 3.7.2软件构建与治疗脑梗死有关的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI) 网络。

利用Cytoscape 3.7.2软件中Merge功能，将参麻颈复颗粒活性成分-预测靶点网络与脑梗死的蛋白质-蛋白质相互作用网络合并，确定两者是否存在交集，通过Cytoscape 3.7.2软件构建参麻颈复颗粒活性成分-潜在靶点网络，系统分析参麻颈复颗粒治疗脑梗死的潜在作用靶点。

采用DAVID数据库( https://david.ncifcrf.gov/home.jsp) ^[15-17]，对与脑梗死相关的参麻颈复颗粒活性成分-潜在靶点网络中的蛋白进行基于KEGG的生物通路富集分析，并利用OmicShare对通路进行可视化，采用DAVID数据库，对与治疗脑梗死相关的参麻颈复颗粒活性成分-潜在靶点网络中的蛋白进行GO功能富集分析。

在TCMSP数据库中对十二味药的活性成分进行检索，共得到183个潜在有效成分（表1），其中有13个为共有成分（表2）。

将筛选出的参麻颈复颗粒183个潜在有效成分导入到TCMSP，查找相应的靶点，得到1785个潜在靶点蛋白，并通过UniProt数据库匹配其蛋白所对应的基因。将结果导入到Cytoscape 3.7.2软件中进行网络构建，得到参麻颈复颗粒主要活性成分靶点网络（见表1和图1）。该网络共有519个节点、1 927条边，矩形方阵中浅蓝色菱形表示单味药的作用靶点、蓝色菱形表示共有的作用靶点、八边形图标表示参麻颈复颗粒活性成分、黄色箭头图标表示共有活性成分。参麻颈复颗粒的活性成分按度值排序，前四名分别为槲皮素、山柰酚、β-谷固醇、豆甾醇。该网络的构建提示参麻颈复颗粒的组成中药均具有多活性成分、多靶点的特点。

在OMIM数据库检索与脑梗死相关的基因，共检索到216个相关基因靶点。参麻颈复有效成份的1785个潜在靶点蛋白，删除重复项后得到384个相关靶点。将成分靶点和疾病靶点输入BioVenn在线软件进行交集分析，绘制韦恩图，筛选出脑梗死与参麻颈复活性成分共有30个共同靶点（图2）。

将参麻颈复颗粒预测所得的基因与脑梗死相关基因进行映射后得到共有靶基因，输入STRING数据库进行蛋白-蛋白相互作用分析。在分析过程中，选取物种为Homosapiens ，并将蛋白-蛋白互作得分>0.7的基因输入Cytoscape 3.7.2进行网络可视化，共有30个节点，253个连线。应用软件中的Network analysis plugin对网络图中节点（Node）进行统计，分析其在图中的作用，自由度（Degree）越大，该节点在网络中的生物功能则越多。同时，颜色越深代表该节点自由度较大、生物功能较多（图3）。进一步对与脑梗死潜在靶点网络进行分析，得到网络中潜在靶点的度值，网络中有20个靶点的度值>16.86（平均度值），可能为参麻颈复颗粒活性成分发挥作用的潜在靶点。

利用DAVID平台进行GO功能富集分析，对与脑梗死相关的参麻颈复颗粒活性成分-潜在靶点网络中涉及的30个蛋白在基因功能中的作用进行研究，得到了151个GO条目，根据P<0.05，筛选出117个GO条目，针对前10条BP分析、CC分析、MF分析绘制直方图（图4）。其中，生物过程相关的条目最多，有74个，结果显示参麻颈复颗粒主要对基因表达的正向调控、白细胞迁移、炎症反应、一氧化氮生物合成过程的正向调节等方面影响较大；分子功能相关的条目23个，结果显示参麻颈复颗粒主要对蛋白质结合、钙离子结合、受体活性、细胞因子活性等方面影响较大；细胞组成相关的条目20个，结果显示参麻颈复颗粒主要对细胞外间隙、质膜、细胞表面、胞外区等方面影响较大。

利用DAVID平台的KEGG通路富集分析功能，对与脑梗死相关的参麻颈复颗粒活性成分-潜在靶点网络中涉及的蛋白信号通路中的作用进行研究，得到19条信号通路，包括补体和凝血级联通路、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、HTLV-I感染、神经活性配体受体相互作用等。

基于上述信息，构建活性成分-靶点-通路图，以全面阐述参麻颈复颗粒脑梗死的作用机制（图5、表3），图中有74个节点和188条边，黄色菱形代表参麻颈复颗粒活性成分，绿色圆形代表潜在靶点，红色箭头代表信号通路，边代表三者之间的相互作用。从结果可以看出参麻颈复方中槲皮素、β-胡萝卜素、柚皮素、西红花酸、大黄素、报春色素苷、表儿茶素等活性成分可能是参麻颈复治疗脑梗死的关键成分。

中药复方具有多活性成分、多作用靶点的特性，通过网络药理学手段，可以有效预测参麻颈复颗粒治疗脑梗死的作用机制。通过药物-化合物-靶点-通路网络的构建，可以发现参麻颈复颗粒中的陈皮、川芎、栀子、蒺藜、杜仲、天麻、首乌藤、山茱萸等药味中的槲皮素^[18]、β-胡萝卜素^[19]、西红花酸、柚皮素^[20]、大黄素、报春色素苷、表儿茶素等活性成分可改善脑梗死患者的预后情况。研究显示槲皮素可通过抑制细胞凋亡和氧化应激水平，改善脑梗死受损神经功能，改善脑纤溶功能。β-胡萝卜素能阻止脑组织因自由基激活的氧化损伤，保护低密度脂蛋白免遭氧化损伤，在降低脑血管病危险因素方面有一定的作用。柚皮素可降低缺血再灌注损伤侧脑组织含水量、缩小脑梗死体积、降低脑组织MDA含量，提高SOD活性，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。通过GO功能富集结果提示，参麻颈复颗粒可能通过作用于纤溶酶原激活物抑制物1、血栓调节蛋白、凝血因子Ⅶ、血管内皮生长因子A等多个靶点，干预血小板激活、改善受损神经功能、保护脑缺血再灌注损伤，从而有助于脑梗死患者的恢复。

脑梗死后出现的炎症反应与脑损伤存在一定的关系，KEGG生物通路富集分析结果提示参麻颈复颗粒在干预脑梗死相关通路中，TNF信号通路和NF-κB信号通路起到了治疗脑梗死后炎症反应的重要作用。 IL-6靶点和TNF信号通路是脑梗死后重要的炎症反应通路^[21]。NF-κB信号通路对炎症反应具有显著的影响，是脑缺血后炎性级联反应的始动因素^[22]，NF-κB被激活，使其调控的靶基因转录活性升高，可诱导TNF和IL-6等炎症因子的产生，促进炎症发生发展和诱导细胞凋亡加重脑缺血的损伤。因此，参麻颈复颗粒可能是通过抑制NF-κB、TNF等炎症信号通路，起到保护脑血管损伤的作用。

HIF-1信号通路参与脑缺血组织的血管再生和血脑屏障的维持^[23]，可以通过调控下游基因的转录，对抗低氧造成的细胞功能紊乱。HIF-1可以调控10余种下游基因的表达和转录，进而对多种细胞的多种生物学活动有重要影响^[24]。因此，参麻颈复颗粒可能通过调节HIF-1信号通路促进对脑血管组织的再生，维持脑梗死患者的血脑屏障，改善脑梗死患者的预后情况。

本研究运用网络药理学的技术和方法，通过中药活性成分的筛选、靶点预测、网络构建与分析，从“药物-化合物-靶点-疾病”的关联性对中药复方参麻颈复颗粒治疗脑梗死的相关作用机制进行分析，预测参麻颈复颗粒治疗脑梗死的主要活性成分、作用靶点及信号通路，为进一步的实验验证提供依据。