Evaluation on genotoxicities of raceanisodamine hydrochloride injection

受试物为复方山莨菪碱注射液,两种成分的化学分子结构式详见图1和图2（无色澄明溶液，批号20101222；规格：5 ml中含盐酸消旋山莨菪碱1 g与甲硫酸新斯的明2 mg；由海军军医大学药学系提供）。溶媒对照为氯化钠注射液（无色透明液体，批号110714K2，安徽丰原药业股份有限公司）。

组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）TA1535、TA102、 TA100、TA98和TA97 5个菌株，由复旦大学公共卫生学院环境卫生教研室赠予，储存于液氮中。实验前进行菌株鉴定，均符合规定标准。CHO细胞由国家上海新药安全评价研究中心赠予。

购自美国MOLTOX公司（批号分别为2765和2715，有效期至：2013-05-17和2012-02-12），保存于−80 ℃冰箱。

选用60只SPF级的ICR小鼠，雌雄各半（上海市西普尔-必凯动物有限公司，合格证号2008001616722）。检疫期为3 d，每日观察动物的外观、粪便和摄食等情况并记录。自购入日起的当日和检疫结束当日共两次称量所有动物的体重（检疫结束时的体重：雌鼠21.24～23.74 g; 雄鼠21.32～23.72 g），且根据该体重将雌、雄小鼠分别按随机区组法分组，共分为6组，每组10只。

按《药物遗传毒性研究技术指导原则》等^[8-9]的设计要求，选用标准试验组合中的细菌回复突变试验 ^[10]，体外染色体畸变试验^[11]和体内微核试验^[12]来全面评价复方山莨菪碱注射液的遗传毒性。

应用组氨酸缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌TA1535、TA102、TA100、TA98和TA97共5种菌株进行测试。对不受溶解度或细胞毒性限制的受试物最高浓度应达到5 mg/皿 ^[10]，故设复方山莨菪碱注射液（以5 ml中含盐酸消旋山莨菪碱1 g与甲硫酸新斯的明2 mg为计）总剂量为0.5、5、50、500、5 000 μg/皿共5组，此外还有对照组，包括空白对照、溶媒对照和阳性对照。按标准的平板掺入法操作，细菌在有或没有S9代谢活化系统（-S9组在每个平皿的试验体系中加入0.5 ml的磷酸缓冲液，+S9组在每个平皿的试验体系中加入0.5 ml的S9混合液）的平行条件下，将相应浓度的受试物溶液、溶媒对照品（氯化钠注射液）或阳性对照品溶液分别加入到无菌的试管中（表1和表2）0.1 ml，每个组别均设3个平行。以上所有物质与顶层琼脂混匀后，迅速铺浇到底层琼脂平板上，待其凝固后倒置培养48~72 h，通过肉眼或显微镜仔细观察各剂量组的菌苔是否正常，区分受试物沉淀与白色菌落，判断是否有由受试物导致的明显抑菌现象，接着采用手工计数的方法记录每皿中全部回复突变的菌落数量，统计3个平行皿的均值和标准差，与溶媒对照组进行比较。按上述操作再验证一次。

采用体外培养的CHO细胞在有或没有S9代谢活化系统的平行条件下进行测试。预试验最高浓度设定为5 mg/ml，再按等比级数设计若干个浓度。正式试验的最高浓度产生的细胞毒性应约为50% ^[11]。故根据预试验测定IC₅₀（50 %细胞生长抑制浓度）为235.0 μg/ml，因此一共设3个剂量组，依次为58.75、117.5和235.0 μg/ml，另设阳性对照组（-S9组为0.5 μg/ ml丝裂霉素C溶液，+S9组为60 μg/ ml环磷酰胺溶液）和溶媒对照组（氯化钠注射液），每个组别均设2个平行。-S9/4 h组和+S9/4 h组：受试物作用细胞4 h后弃全部培养基，用PBS洗涤后重新添加新的10 ml 1640完全培养基，放入培养箱中继续培养至24 h后收集细胞；-S9/24 h组：受试物作用细胞24 h后收集细胞。终止培养前4 h加入20 μg/ml秋水仙碱，目的是使大部分细胞的有丝分裂停止在中期相，所有细胞依次经过0.75% KCl低渗、固定（甲醇∶冰乙酸=3∶1）、涂片和Gimsa染色处理，在显微镜下选择染色体数目完整且分散良好的中期分裂相染色体作为观察对象，观察染色体数量和结构的改变。分别记录各组含有结构畸变染色体的细胞数和畸变类型（表3），计算每组的染色体畸变率。

采取与临床拟用途径一致的给药方式^[12]，对ICR小鼠采用单次经尾静脉注射的给药方式。根据受试物急性毒性的试验结果：半数致死量LD₅₀为60.4 mg/kg。本次试验的最高剂量为1/2 的LD₅₀，最高剂量之下的其他剂量保持剂量间距为2～3倍^[12]。故共设3个剂量组（分别为7.5、15.0和30.0 mg/kg），及溶媒对照组（氯化钠注射液，给药方式与受试物组相同）和阳性对照组（剂量为40 mg/kg的环磷酰胺溶液，临用时用氯化钠注射液配制成4.0 mg/ml的环磷酰胺溶液，给药方式为单次腹腔注射），给药容积均为10 ml/kg。因此，总共有六组，其中的高剂量组有两组，分别在药物作用24 h和48 h后处死，除高剂量48 h组外，其他组均在药物作用24 h后处死。取小鼠两侧大腿股骨制备骨髓涂片，每只小鼠制2张骨髓片，自然干燥后染色。所有动物均镜检约1 000个嗜多染红细胞（PCE），计数含微核的PCE数（MNPCE），统计微核发生率，在记录200个PCE的同时计数观察到的所有正染红细胞（NCE）的数量（表4），通过PCE/NCE值来评价受试物是否具有骨髓毒性。

细菌回复突变试验的结果判定是将各剂量组的受试物与溶媒对照组的回复突变菌落数进行比较，如果某个组别的回复突变菌落数是溶媒对照组突变菌落数的2倍及以上，且可重复性，并在剂量范围内存在着剂量-反应关系，则判断为阳性；体外染色体畸变试验和体内微核试验的结果，也是与溶媒对照组进行比较，均采用卡方检验，检验标准以P<0.05为有统计学差异。

所有平皿经均未见杂菌污染，可观察到目标菌苔的正常生长。所有菌株的自发回复突变菌落数和阳性物诱发的回复突变菌落数都在历史对照数据库的范围内，且阳性对照组与空白对照组相比回复突变菌落数是显著增加的，该结果提示整个试验系统符合要求^[13-17]。最高浓度已达到5 mg/皿时，未观察到复方山莨菪碱注射液的抑菌现象。两种平行条件下，即有或没有S9代谢活化系统中，各剂量组的受试物所诱发的回复突变菌落数均与自发的回复突变菌落数接近，未见明显的剂量-反应关系。两次结果见表1和表2。

经显微镜观察，阳性对照组能显著诱发细胞染色体的畸变，与溶媒对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05），验证了该系统的有效性^[13-17]；复方山莨菪碱注射液各剂量组的CHO细胞染色体畸变率与溶媒对照组相比差异均无统计学意义（P>0.05），结果见表3。

各剂量组小鼠在给药后未见异常，且未出现动物死亡。雌、雄小鼠在给予阳性对照品后，其骨髓嗜多染红细胞的微核发生率与溶媒对照组相比均有统计学意义（P<0.05），提示试验系统符合要求^[13-17]。复方山莨菪碱注射液各剂量组的雌、雄小鼠骨髓PCE/(PCE+NCE) > 50%，即受试物对骨髓无抑制作用，各剂量组微核率与溶媒对照组相比均无统计学意义（P>0.05）。结果见表4。

作为单药，山莨菪碱与甲硫酸新斯的明均已进行过完整的遗传毒性评价，且皆为阴性。但既往研究表明，药物联合作用可改变单药的致突变性。用TA98、TA100和TA102菌株对顺铂和卡铂与新斯的明、博莱霉素、5-氟尿嘧啶和长春新碱联合用药的遗传毒性进行评价，发现药物之间的相互作用会产生抗致突变性作用，联合用药时的致突变性比单药要低^[18]。复方山莨菪碱是由盐酸消旋山莨菪碱与甲硫酸新斯的明按照500:1的比例组成的复方注射剂，为考察其是否会产生与单药不同的遗传毒性，本研究按照《药物遗传毒性研究技术指导原则》^[8]推荐的组合方法，分别从体外到体内，从微生物、离体细胞和整体动物水平上对复方山莨菪碱注射液的遗传毒性进行了评价，该试验组合能检测染色体畸变、基因突变等多个遗传学终点^[8-9]。Ames试验表明复方山莨菪碱注射液在0.5、5、50、500、5 000 μg/皿受试剂量下，两种平行条件下，即有或没有S9代谢活化系统时，与溶媒对照组的突变菌落数进行比较，各剂量组所诱发的回复突变菌落数均和其相近。CA试验结果表明58.75、117.5和235.0 μg/ml 3个剂量的受试物，所有剂量在两种平行的系统条件下（即有或没有S9代谢活化系统时）对CHO细胞的染色体无明显的畸变影响。MNT试验设的7.5、15.0和30.0 mg/kg 3个剂量，对ICR小鼠骨髓的微核诱发率均无统计学意义（P>0.05）。以上结果显示，在本实验条件下,复方山莨菪碱注射液对鼠伤寒沙门氏菌无致突变性，对哺乳动物培养细胞染色体无致畸变作用，对ICR小鼠骨髓嗜多染红细胞无诱发微核的效应；此也提示复方山莨菪碱注射液在受试条件下对人体不具有潜在致癌性和遗传毒性。

综上可知，在本实验条件下结果提示复方山莨菪碱注射液不具有遗传毒性和潜在致癌性，与单方相关的文献报道结论基本相符，本研究结果为该药的临床安全性评价提供了前期科学依据。