Mechanism of Artemisia annua L. in GIOP with kidney-yin deficiency based on network pharmacology

骨质疏松症（osteoporosis, OP）是一种以骨密度（bone mineral density, BMD) 降低、骨量丢失、骨微结构破坏为主要特点的全身代谢性骨病，以骨脆性增加、易发生骨折为主要特征^[1]。随着老龄化的加剧，OP的发生率越来越高，在我国50岁以上的人群中，OP的发生率为19.2%，其中女性为32.1%，男性为6.0%^[2]。OP可分为原发性OP和继发性OP，在继发性OP中，糖皮质激素性OP（glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP）的发生率排在第一位^[3]，目前骨质疏松症（OP）是一种以骨密度（BMD) 降低、骨量丢失、骨微结构破坏为主要特点的全身代谢性骨病，以骨脆性增加、易发生骨折为主要特征^[1]。随着老龄化的加剧，OP的发生率越来越高，在我国50岁以上的人群中，OP的发生率为19.2%，其中女性为32.1%，男性为6.0%^[2]。OP可分为原发性OP和继发性OP，在继发性OP中，GIOP的发生率排在第一位^[3]，GIOP治疗上西医使用的药物有钙制剂、活性维生素 D、双磷酸盐类以及雌激素等，这些药物不仅忽略了糖皮质激素这个罪魁祸首，还有可能产生一系列的副作用^[4]，寻找安全有效且有针对性的药物显得尤为重要。

中医认为糖皮质激素是“纯阳”之品^[5]，使用过量易伤阴津；肾主骨，肾虚是导致骨质疏松的关键病机，因此，肾阴虚证是GIOP的一个主要证型，临床研究也证明，肾阴虚证是GIOP患者的一个易患证型^[6]。青蒿为菊科蒿属植物黄花蒿植物Artemisia annua L.的干燥地上部分，分布遍及全国，味苦、辛，性寒，归肝、胆经，具有清虚热、除骨蒸的作用^[7]，对于过量使用糖皮质激素造成的阴虚火旺、烦躁不安，有一定的疗效，临床上也常用青蒿加减处方治疗糖皮质激素使用过度，造成阴虚火旺、虚火上炎的病症^[8-9]，同时，体内实验发现，青蒿在多种骨丢失模型动物上，可以促进骨组织的再生，提高骨密度^[10]，青蒿在治疗骨质疏松方面具有广阔的应用前景。然而，目前关于青蒿治疗OP，特别是在GIOP方面的研究尚有限，为此，本研究应用网络药理学和体外实验，结合中医基础理论知识，研究青蒿治疗肾阴虚型GIOP的关键靶点和信号通路，以期明确中药青蒿抗肾阴虚型GIOP的作用及机制，为骨质疏松的临床治疗提供新思路和方法。

在GeneCards数据库（https://www.Genecards.org）、OMIM数据库（https://omim.org）和Drugbank数据库（https://go.drugbank.com）中，以“glucocorticoid induced osteoporosis”作为关键词进行检索，获得GIOP的靶点基因，去除两个数据库的重复结果，获得GIOP疾病靶点基因。

根据全国中西医结合虚证与老年病研究专业委员会^[11]1986年对虚证辩证标准的修订，阴虚证诊断标准：主证：①五心烦热（palms and soles）；②咽燥口干（dry throat and thirst ）；③舌红或少苔、无苔（red tongue or less fur or without fur）；④脉细数（thin and rapid pulse）。次证：①午后升火（tidal fever）；②便结而尿短赤（constipation and scanty dark urine）；③盗汗（night sweating）。诊断条件：具备主证3项，次证1项。在GeneCards数据库中，对各症状关键词进行检索，筛选出4个主证检索结果中至少出现3次的靶点，与次证检索结果交叉分析后得到阴虚靶点。肾虚证诊断标准为：①腰脊酸痛（soreness and weakness of waist）；②胫酸膝软或足跟痛（soreness and weakness of knees or heel pain）；③耳鸣或耳聋（tinnitus or deaf）；④发脱或齿摇（alopecia or toothmobilit）y；⑤尿后有余沥或失禁（urinary incontinence or poor urination）；⑥性功能减退、不育、不孕（sexual dysfunction and infertility or sterility）。诊断条件：具备3项。在GeneCards数据库中，对各症状关键词进行检索，筛选出至少出现3次的靶点为肾虚靶点。将阴虚靶点与肾虚靶点交叉分析后获得肾阴虚靶点。将GIOP疾病靶点与肾阴虚靶点交叉分析后获得肾阴虚型GIOP靶点。

在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP：http://tcmspw.com/tcmsp.php）上，以Herb：青蒿、OB≥30%、DL≥0.18为条件进行检索，确定青蒿的活性成分。

利用TCMSP的靶点预测模型，进一步预测青蒿活性成分的相关靶点，通过UniProt数据库（http://www.Uniprot.org/）对预测靶点添加基因名。最后利用微生信在线软件（http://www.bioinformatics.com.cn/）将肾阴虚型GIOP靶点基因与青蒿靶点基因进行交集分析，并绘制出韦恩图。

将“青蒿-肾阴虚型GIOP”共同靶点基因数据导入String在线软件（https://string-db.org /），选择种属为“Homo sapiens”，设置最小互作得分为0.4，构建出PPI网络，将数据导入Cytoscape软件中进行可视化分析，并利用CytoNCA插件进行拓扑分析，以度中心度（DC）和介度中心度（BC）均大于上四分位数的靶点作为核心靶点，进一步分析。

为进一步阐述青蒿对肾阴虚型GIOP的作用机制，将“青蒿-肾阴虚型GIOP”共同靶点基因数据导入metascape数据库（https://metascape.org/gp/index.html）进行GO功能富集分析和KEGG功能富集分析，并通过微生信在线软件绘制相关柱状图和气泡图。

青蒿购于河北安国市场，经海军军医大学药学系生药学教研室辛海量副教授鉴定，密封存放于干燥阴凉处。称取青蒿粉末1g，加入60%乙醇50 ml，室温冷浸7 d，过滤得滤液，55 ℃旋蒸浓缩后，55 ℃烘干备用^[12-13]。

其他试剂及生产厂家：地塞米松（大连美仑）；胎牛血清（Gibco，美国）；DMEM培养基等细胞培养试剂（天津灏洋）；碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（南京建成）；BCA蛋白检测试剂盒、MTT（上海碧云天生物技术有限公司）；PI3K、AKT、p-AKT、GADPH抗体（CST公司）。

以二次消化法从新生大鼠颅骨盖中分离获得原代成骨细胞^[14]。

以含10%胎牛血清和1%青/链霉素的DMEM培养基培养成骨细胞，置于37 ℃、5%CO₂培养箱中培养，待细胞铺满80%~90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。

取3-8代的成骨细胞计算其数目，配制成细胞浓度为1×10⁴ 个/ml细胞悬液接种于96孔板。24 h后分别更换为含药培养液（DEX: 10 μmol/L；AE: 100、50、 25 μg/ml）。给药48 h后采用MTT法检测成骨细胞的增殖情况。

取3-8代的成骨细胞计算其数目，配制成细胞浓度为5×10⁴ 个/ml细胞悬液接种于24孔板。24 h后分别更换为含药培养液（给药浓度同上）。培养过程中每3 d更换1次含药培养液。第8d裂解细胞，收集细胞裂解液，于4 ℃、13800×g 离心5 min。用对硝基苯磷酸二钠法测定细胞ALP活性。

将3-8代的成骨细胞裂解，提取细胞总蛋白，根据BCA试剂盒进行蛋白定量。采用Western-blot技术对PI3K、AKT和p-AKT水平进行检测。

实验结果以“均值±标准差”（$ \bar x$±s）表示。采用SPSS 22.0软件进行数据分析，选用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行组间变量的比较分析。

通过Genecards数据库共检索到GIOP相关靶点基因1741个，通过OMIM数据库共检索到GIOP相关靶点基因311个，通过Drugbank数据库共检索到GIOP相关靶点基因30个，将3个数据库检索结果合并后去除重复基因后，最终获得2039个。通过Genecards数据库检索获得阴虚靶点基因876个，肾虚靶点基因4603个，交叉分析后获得肾阴虚靶点基因836个。将肾阴虚靶点基因和GIOP靶点基因交叉分析后获得522个肾阴虚型GIOP靶点基因（图1）。

通过TCMSP平台共检索到青蒿中OB≥30%，DL≥0.18的活性成分22个，见表1。

通过TCMSP和UniProt数据库获得214个青蒿活性成分靶点基因。将其与肾阴虚型GIOP疾病靶点基因交叉分析（图1），“青蒿-肾阴虚型GIOP”交集靶点基因共有98个。

运用String在线软件构建出“青蒿-肾阴虚型GIOP”共同靶点PPI网络（图2），共有98个节点，1935条相互关系，见图2。利用CytoNCA插件计算网络节点的DC，BC上四分位数为59、101.49248，故以DC≥59、BC≥101.49248为筛选条件，筛选青蒿治疗肾阴虚型GIOP的核心靶点，共得到17个核心靶点，如表2。

GO富集分析获得5612个细胞生物学过程，其中BP分析获得4649个条目，MF分析获得585个条目，CC分析获得378个条目，根据富集的基因数进行降序排列，分别选取前10个条目建立BP、MF、CC三合一柱状图（图3）。生物学过程（BP）主要涉及激素应答、性腺发育、细胞死亡的正向调节等，细胞成分（CC）包括细胞外基质、转录调节复合物、膜筏等，分子功能（MF）包括信号受体调节活性、蛋白结构域特异性结合、激酶结合等。

KEGG富集分析获得225个信号过程，根据富集的基因数进行降序排列，选取前20个条目建立气泡图（图4），KEGG富集分析主要涉及的信号通路有PI3K/AKT信号通路，IL-17信号通路，AGE/RAGE信号通路，MAPK信号通路等，说明青蒿治疗肾阴虚型GIOP可能是从多条信号通路联合发挥作用的，其中PI3K/AKT信号通路上富集的共同靶点最多。

DEX损伤成骨细胞后，其增殖能力及ALP活性显著降低。药物治疗后，青蒿提取物可显著促进DEX损伤的成骨细胞的增殖，提高ALP活性，促进DEX损伤的成骨细胞的增殖（图5）。

药物处理DEX损伤的成骨细胞48 h后，Western blot结果显示，与空白组比较，模型组p-AKT/AKT比值、PI3K蛋白表达水平明显下降，给予青蒿提取物治疗后，p-AKT/AKT比值、PI3K蛋白表达水平明显提高（图6）。

研究发现，PI3K/AKT通路与氧化应激有密切的联系，一方面，过量的活性氧（ROS）可抑制AKT的磷酸化^[15]，另一方面，磷酸化的AKT也可以通过Nrf2/HO-1通路抑制氧化应激^[16]。在OP的治疗药物探索过程中，抗氧化是一条重要的线索，如啤酒花中的黄腐酚，杜仲中的绿原酸，黄连中的小檗碱，其抗骨质疏松的机制均与抗氧化有关^[17-19]，现代药理研究已经证明青蒿具有抗氧化，抗炎，调节免疫等作用^[20-21]，但青蒿中化学成分众多，虽然目前多以倍半萜类成分青蒿素含量作为其质量评价标准^[22]。然而，除了倍半萜类成分外，青蒿中还存在黄酮类成分、有机酸类成分等等^[23]，青蒿的抗肾阴虚型GIOP的机制可能与抗氧化有关。研究发现，倍半萜类成分、黄酮类成分、有机酸类成分均存在一定的抗氧化效果^[24-27]，青蒿的抗肾阴虚型GIOP的机制可能与抗氧化有关。因此，研究青蒿是否在抗OP方面存在作用，青蒿中哪种单体成分在其抗OP的过程中起主要作用值得进一步探究。

本研究以网络药理学为基础，初步筛选出了青蒿抗肾阴虚型GIOP的98个共同靶点，通过拓扑分析，筛选出了17个核心靶点。GO分析和KEGG富集分析发现这些共同靶点参与了多个生物学过程，且参与PI3K/AKT，IL-17，AGE/AGE，MAPK等多个信号通路，其中PI3K/AKT信号通路上富集的共同靶点最多。研究表明，PI3K/AKT信号通路可通过影响成骨细胞的增殖和分化，抑制OP的发生^[28]。本研究体外实验亦证实青蒿可以促进DEX损伤的成骨细胞的增殖和分化，激活PI3K/AKT信号通路，促进AKT的磷酸化，验证了网络药理学的预测结果，为后续青蒿抗GIOP研究提供了科学依据。