Cordyceps sinensis extract protects against the ovariectomy-induced bone loss via the action on osteoclasts

SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。

α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。

371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。

冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文^[12]。

选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×10⁶个^[13]。

在96孔板中，BMMs以8×10³个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。

在96孔板中，BMMs以6×10³个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。

将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色^[14]。

在96孔板中，BMMs以6×10³个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。

骨吸收实验：BMMs以5×10⁵个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×10³个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积^[15]。

在12孔板中，BMMs以5×10⁴个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文^[16]。

在6孔板中，BMMs以5×10⁵个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。

在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）^[14]。术后1周，按照文献报道方法^[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。

小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。

小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。

使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（$\bar x $±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。

CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。

TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。

在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。

鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。

骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。

q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。

Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。

HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。

ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。

骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因^[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径^[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。

研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞^[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标^[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。

F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能^[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。

我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性^[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性^[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环^[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。

总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。