Effect of traditional Chinese medicine Syngnathus on D-galactose-induced learning and memory impairment in aging mice

3月龄雄性ICR小鼠，体重（28±2）g，清洁级，购自昭衍（苏州）新药研究中心有限公司，合格证编号：No.202009910；许可证号：SCXK（苏）2008-0006。动物饲养于海军军医大学药学系实验动物中心，室温控制在（24±0.5） ℃，12 h光照/12 h黑暗，自由饮水、饮食。

D-半乳糖、羧甲基纤维素钠（Sigma公司）；脂质过氧化物丙二醛（MDA）试剂盒、总超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物（上海碧云天生物技术有限公司）；AKT、p-AKT、FOXO1、SOD2、GAPDH抗体（CST公司）；二十二碳六烯酸（DHA，纯度≥98％）购自上海麦克林生化科技有限公司。

海龙（购自安徽亳州药材市场）经海军军医大学药学系生药学教研室辛海量教授鉴定为刁海龙。精密称取干燥海龙生药，剪碎，以料液比为1:10的80%乙醇浸泡12 h，80%乙醇冷凝回流提取2次，90%乙醇冷凝回流提取1次，每次回流提取2 h，过滤，合并滤液，减压浓缩干燥为浸膏。

色谱柱：Acclaim^TM120 C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05％磷酸水溶液梯度洗脱；流速：0.6 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：203 nm；进样量：20 μl。

精密称定海龙乙醇提取物浸膏，配制成0.04 g/ml（以生药计）乙醇溶液；精密称取DHA对照品，溶解配置成0.5 mg/ml乙醇溶液。供试品溶液及对照品溶液均经0.45 μm微孔滤膜过滤除菌，备用。

将24只小鼠随机分为空白组、模型组、海龙低剂量组、海龙高剂量组，每组6只。对照组腹腔注射生理盐水，其余3组小鼠均腹腔注射D-gal（150 mg/kg），每周3次，复制衰老动物模型。海龙低、高剂量组给药剂量为1、2 g/kg（以生药计），空白组、模型组灌胃CMC-Na溶液，每周灌胃给药6 d。给药体积为0.1 ml/10 g，每周称重1次，给药量随体重变化增减，连续造模给药12周。

水迷宫实验的前1~4 d为定位航行测试，第5天为空间探索实验。定位航行测试：将各组小鼠从水池4个象限放入水中，记录60 s内小鼠从入水至达平台并停留超过3 s所需时间（即逃避潜伏期），测试4 d，观察各组小鼠逃避潜伏期时间变化。空间探索实验：Morris水迷宫测试第5天，移除平台后，将小鼠从原平台对侧象限放入水中，记录小鼠60 s内的活动轨迹，并分析数据。

水迷宫试验结束后处死小鼠，冰上迅速摘取小鼠海马组织。取部分海马组织加入生理盐水匀浆、离心，收集匀浆上清液，BCA法测定蛋白浓度后调整各样本蛋白浓度至一致，严格按照说明书检测小鼠海马组织匀浆上清液中MDA含量及SOD活性。

以细胞裂解液制备海马组织匀浆，离心后收集上清液，并以BCA法测定蛋白浓度。海马组织上清液蛋白加热变性后进行十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），PVDF膜转印后，室温下5％脱脂牛奶封闭1 h。一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，次日TBST洗膜3次，每次10 min。二抗（1∶10 000）室温孵育1 h后，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL化学发光法显影，ImageJ软件对目的条带进行分析。

实验结果以（$ \bar x \pm s $）表示，采用SPSS 21.0软件进行数据分析，选用单因素方差分析法进行组间变量分析，LSD-t法比较组间差异。以 P ＜0.05表示有显著性差异，以 P ＜0.01表示有极显著性差异。

取对照品溶液，按照“2.2.1”项下方法进样测定。以峰面积为纵坐标、对照品浓度为横坐标进行回归处理，得DHA回归方程：Y=1 085.8X+4.799 9，相关系数r=0.999 9，线性范围0.034~0.41 mg/ml；取供试品液，按照“2.2.1”项下方法进样测定，并计得含量为7.761 3 mg/g（以生药计），见图1。

小鼠定位航行实验结果：与空白组相比，模型组小鼠在定位航行实验第4天逃避潜伏期明显延长（P<0.01）；与模型组比较，海龙低剂量组、高剂量组小鼠逃避潜伏期均显著缩短（P<0.01），见图2。

空间探索实验结果：与空白组比较，模型组小鼠目标象限游泳时间占比和游泳路程占比显著降低；与模型组比较，海龙高剂量组穿台次数显著增加（P<0.01）；海龙低剂量组、海龙高剂量组目标象限游泳时间占比和游泳速度显著提高（P<0.01），见图3。

与空白组相比，模型组海马组织MDA含量显著升高，SOD活力显著降低（P<0.01）；与模型组比较，海龙低剂量组、海龙高剂量组海马组织MDA含量显著降低（P<0.01），SOD活力显著升高（P<0.05, P<0.01），且高剂量组小鼠海马组织氧化损伤程度较低，见图4。

与空白组相比，模型组小鼠海马组织p-AKT/AKT比值、FOXO1、SOD2蛋白表达降低；海龙给药组可显著上调D-gal诱导记忆损伤小鼠海马组织中p-AKT、FOXO1、SOD2蛋白表达，激活AKT/FOXO1/SOD2通路（图5A-C），改善学习记忆损伤小鼠海马组织氧化损伤。

氧化应激损伤与衰老密切相关。研究发现，氧化应激致机体衰老的主要机制是因过量的ROS导致线粒体损伤、脂质过氧化、抗氧化酶活力降低，进而诱导细胞周期停滞甚至细胞凋亡^[6-7]；同时自由基也会导致氧化损伤，并且自由基清除酶活力随年龄增长而降低，进一步导致机体氧化损伤加剧^[8-9]。海马组织作为负责短时记忆储存转换与空间导航的器官^[10]，与学习记忆能力密切相关。研究发现^[11]，过量D-gal可诱导小鼠体内氧化应激加剧，导致海马组织神经元细胞损伤，从而导致动物学习记忆能力降低。本研究发现，经海龙给药干预后，小鼠海马组织MDA含量显著降低，SOD活力显著提高，学习记忆能力显著提高。表明海龙可通过降低海马组织氧化损伤改善D-gal诱导衰老小鼠学习记忆损伤。

PI3K/AKT/FOXO1信号通路是经典的抗氧化通路，能拮抗多种原因引起的氧化应激。AKT信号通过磷酸化活化激活下游mTOR、FOXOs家族蛋白表达^[12]，从而发挥抗氧化作用。FOXO1作为PI3K/AKT信号通路的重要作用底物，在细胞抗氧化应激反应中发挥重要作用。研究发现，FOXO1激活可以促进其下游抗氧化蛋白SOD2、CAT表达^[13]。此外，FOXOs转录因子表达的减少也增加了氧化应激诱导细胞凋亡的易感性^[14]。本研究发现，D-gal模型组小鼠海马组织p-AKT/AKT比值、FOXO1、SOD2蛋白表达降低，海龙给药组小鼠海马组织p-AKT/AKT比值、FOXO1、SOD2蛋白表达显著提高。表明海龙可通过激活AKT/FOXO1/ SOD2信号通路改善小鼠海马组织氧化损伤，进而改善D-gal诱导衰老小鼠学习记忆能力。

海龙为海龙科硬骨鱼类，富含多种脂肪酸、氨基酸、甾体类成分。研究发现^[15-16]，鱼类所含的不饱和脂肪酸类代表成分DHA可促进大脑神经元细胞发育，并通过激活Nrf2/HO-1通路、FOXO3a/SOD通路，促进抗氧化相关蛋白及基因表达，降低活性氧水平，从而减轻神经元细胞氧化及炎症损伤，改善记忆损伤。此外，DHA可通过上调包括小胶质细胞和星形胶质细胞在内的神经胶质细胞AKT、Nrf2、HO-1等氧化应激相关蛋白表达，提高抗氧化酶活性从而抑制细胞凋亡，间接防止神经元细胞损伤^[17-18]。本研究通过建立海龙HPLC图谱，发现DHA为海龙主要化学成分之一，约占总成分的47％，推测海龙改善小鼠学习记忆损伤作用可能与其富含DHA有关，其作用机制有待进一步研究。