Mechanism of Psoralea corylifolia Linn on liver injury based on bioinformatics

TCMIP (http://lsp.nwu.edu.cn/, Version 2.3)；Pharm Mapper (http://59.78.96.61/pharmmapper/)；Uniprot数据库中UniprotKB检索功能（http://www.uniprot.org/）；String数据库（https://string-db.org/, Version 4.5.0）；Disgenet（https://www.disgenet.org/）；DAVIA基因富集分析网站 (http://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)；Cytoscape软件(Version 2.7.1)；Chembiodraw Ultra软件 (Version14.0)

通过TCMIP数据库获取补骨脂所有化学成分，再结合文献挖掘与整理，筛选出补骨脂的主要成分，并对成分进行预测。

登陆Pharm Mapper服务器，上传上述补骨脂成分，获得虚拟筛选结果。利用UniProt数据库中UniProtKB搜索功能，输入蛋白名称，限定物种为人，预测补骨脂成分的作用靶点。

在Disgenet数据库中搜索药物性肝损伤相关的基因，去除重复基因和假阳性基因，与上述Pharm Mapper 服务器中返回的靶点相匹配，得到补骨脂成分诱导肝损伤的潜在作用靶点。

将补骨脂诱导肝损伤的作用靶点导入String数据库，利用Multiple proteins工具，选择“Homo Sapiens”为生物体，获取蛋白相互作用。将补骨脂成分和作用靶点信息以源节点和节点直接导入Cytoscape3.7.1，构建药材-成分-靶标-疾病网络。借助Network Analyzer工具对网络进行拓扑参数分析，并筛选出补骨脂诱导肝损伤的关键靶蛋白。

用DAVID 6.7 (http://david.ncifcrf.gov/summary.jsp) 对补骨脂药物性肝损伤PPI网络中的节点蛋白进行GO注释和KEGG通路分析，并采用R软件对结果进行图形化表示。

从TCMIP数据库中共筛选出的32个相关化合物，其中补骨脂素、补骨脂酚、补骨脂查尔酮、异补骨脂素和甲氧补骨脂素等22个符合Lipinski5规则，而补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚为补骨脂主要成分。因此，上述22个化合物全部纳入进一步研究，化合物名称及详细信息见表1。

将补骨脂22个成分输入Pharm Mapper中，得到所有潜在蛋白质靶点，经UniProt转化为基因ID，并与Disgenet数据库中8类药物性肝损伤挖掘的疾病基因ID根据匹配度由高到低进行排序，去除重复后，匹配共得到31个补骨脂潜在的肝损伤作用靶点，见表2。

采用Cytoscape软件的Merge功能构建补骨脂成分-靶点-信号通路-肝损伤网络模型，如图1所示（绿色椭圆代表靶点，黄色椭圆代表成分，粉红色菱形代表疾病，紫色椭圆表示补骨脂），节点代表活性或靶点，边代表成分、作用靶点和疾病间的相互关联，其中共有60个节点，327个边。节点的大小与度的大小呈正比关系，节点越大表示该节点的度越大。依据拓扑分析，13个成分的度值大于10，分别为补骨脂素、补骨脂定、补骨脂酚、异新补骨脂查尔酮、异补骨脂黄酮、补骨脂异黄酮醛、异补骨脂定、双羟异补骨脂定、新补骨脂查尔酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂乙素、补骨脂查尔酮、新补骨脂异黄酮；具有较高度值的靶点蛋白有血清白蛋白（ALB）、谷胱甘肽S-转移酶P（GSTP1）、运甲状腺素蛋白（TTR）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）。

采用DAVID在线富集平台进行生物学功能分析，获得103个GO注释（黄色表示生物学过程、绿色表示细胞组成、蓝色表示分子功能）。GO分析表明，靶蛋白大多富集于RNA聚合酶Ⅱ启动子启动转录、类固醇激素介导的信号通路、信号转录、DNA模板转录正调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、氧化还原反应、固有免疫应答、细胞对脂多糖（LPS）的反应、细胞氧化解毒等生物学过程，见图2。此外，KEGG富集分析表明，5条通路（P<0.05）受补骨脂的影响，包括化学物致癌、AMPK信号通路、PPAR信号通路、肝药酶P450（CYP）有害物代谢和谷胱甘肽代谢通路等，结果见图3。

在临床上，补骨脂被广泛应用于治疗骨质疏松、银屑病等多种疾病，其所导致的药物性肝损伤已引起人们关注，但对于其肝损伤成分及分子机制的研究尚不深入。为了探究补骨脂所致肝损伤的作用机制，本研究从补骨脂的成分出发，借助生物信息学技术构建了补骨脂药材-成分-靶点-信号通路-肝损伤网络，分析补骨脂中成分与靶点的作用关系，为其导致肝损伤作用机制研究提供了参考。

通过数据库检索，我们发现补骨脂主要含有补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚、补骨脂定、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮甲醚等22个成分^[1-5] ，其中补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚等为主要成分^[5-6]。补骨脂中个别成分已被发现具有导致肝损伤的作用，如研究发现补骨脂素与补骨脂酚可通过降低BSEP蛋白的表达，升高NTCP和CYP7A1蛋白的表达，使得进入肝细胞的胆汁酸增多，进而肝细胞中胆汁酸的含量异常升高，最终导致胆汁淤积性肝损伤^[7-9]；此外，补骨脂素通过上调细胞周期蛋白E1和p27蛋白水平并下调细胞周期蛋白D1的水平，使肝细胞周期阻滞进而导致肝再生和代偿能力下降而诱发小鼠轻度肝损伤和L02肝细胞损伤；而异补骨脂素通过抑制MRP2和MRP3导致HepG2的细胞肝损伤^[10-11]。补骨脂酚在体外的生物利用度远低于补骨脂素和异补骨脂素，但在体内补骨脂酚的CYP450代谢作用较强^[12]，补骨脂酚在体内复杂环境中的吸收和代谢可能是导致其在体内外肝损伤差异的主要原因。

通过GO分析整合预测，得到补骨脂导致肝损伤生物功能包括氧化还原反应、固有免疫应答、细胞对LPS的反应、细胞氧化解毒等。目前已知，氧化还原反应与免疫应答在药物性肝损伤发病机制中起关键作用。有研究发现，可溶性T细胞免疫球蛋白结构域和含黏蛋白结构域分子-3（sTIM-3）通过促进自噬和调节单核/巨噬细胞功能，减轻炎症反应和肝损伤^[13]。氧化应激介导的脂质过氧化可导致胶原合成增加，氧化还原稳态失衡会干扰线粒体功能障碍进而导致药物引起的肝损伤。ROS可影响过氧化物酶体增殖物激活的受体调节脂肪酸氧化以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和相关的应激敏感激酶活力而调节肝细胞凋亡^[14]。LPS参与了肝损伤中炎症或免疫破坏，可通过激活TLR-2和TLR-4途径促进炎症活动，并且LPS诱导的短暂缺血破坏了呼吸链复合物的活性，增强了ROS，从而进一步增强肠道高通透性，并能显著诱导肝损伤^[15-16]。

KEGG富集分析结果表明，补骨脂所致肝损伤可能涉及AMPK、PPAR、CYP等多条信号通路。AMPK是NF-κB的上游蛋白，被认为是维持ADP/AMP/ATP水平的关键细胞代谢传感器，AMPK信号通路的激活可抑制非典型NF-κB途径，从而保护肝脏免受损伤^[17-18]。PPAR信号通路在肝损伤和肝纤维化中起着关键作用，在活化的HSCs中，PPAR-γ活性降低，从而导致HSCs从维甲酸储存状态向产生ECM的肌成纤维细胞转化，可促进CCl₄诱导的肝损伤和纤维化，然而，抑制PPARG可阻止Fsp27α mRNAs的表达，进而减少乙醇诱导小鼠线粒体活性氧生成所导致的肝损伤^[19-20]。肝脏CYP酶在药物代谢和清除中发挥关键作用，例如CYP2E1可增加活性氧的数量，进而导致氧化应激肝损伤^[21-22]。基于上述结果和理论基础，有必要开展补骨脂AMPK、PPAR等信号通路的作用研究，从而为其肝损伤机制提供理论依据。

综上所述，本研究通过生物信息学技术构建补骨脂药材-成分-靶点-信号通路-肝损伤网络对补骨脂成分所致肝损伤作用机制进行分析预测，研究结果充分表明了补骨脂多成分-多靶点-多通路的肝损伤作用特点，为进一步开展补骨脂致肝损伤作用机制的研究提供了新思路。