Effect of leonurine on peritoneal macrophages M1/M2 phenotypic differentiation via inhibiting overactivation of NLRP3 inflammasome

益母草碱（纯度>98%，西格玛奥德里奇贸易有限公司，上海）；脂多糖（L6143）、DMEM高糖培养基、胎牛血清、NuPAGE 10% Bis-Tris Gel、10×MOPS SDS 运行缓冲液、10×传输缓冲液、预制蛋白Marker、荧光定量PCR、反转录试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司）；青-链霉素混合液、胰蛋白酶（美国Hyclone公司）；Griess试剂盒（江苏碧云天生物试剂公司）；IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α等ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物公司）；PVDF膜（美国Millipore公司）；caspase-1兔抗单克隆抗体、β-actin兔抗单克隆抗体、羊抗兔/羊抗鼠单克隆二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；NLRP3兔抗单克隆抗体（英国Biorbyt生物试剂公司）；四甲基偶氮唑蓝溶液（MTT，美国Bio-Rad公司）；TRIzol Regent试剂盒（日本TaKaRa公司）。

C57BL/6小鼠，6周龄，雌性，体重(20±2) g，购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司。小鼠饲养于实验室SPF级动物房，温度（22 ± 1）°C和湿度（60 ± 2）%，动物自由饮食。动物实验操作均通过实验动物伦理委员会批准。

以颈椎脱臼的方式处死小鼠，置于75%的乙醇溶液中浸泡10 min，将15 ml PBS缓冲液注入小鼠腹中，仰卧平放，揉捏小鼠腹部5 min，吸出腹液，离心分离巨噬细胞，用DMEM培养液调整细胞浓度，在细胞培养箱中以5%CO₂、37 ℃恒温孵育24 h后，换液，去除未贴壁细胞，即得到纯化的小鼠腹腔巨噬细胞^[7]。以1.5×10⁵个/ml密度接种于24孔（或96孔）板中培养24 h后，随机分为空白组、益母草碱（10 μmol/L）组、脂多糖（1 μg/ml）组、脂多糖+益母草碱（10 μmol/L）组，益母草碱预处理1 h之后加入脂多糖，放回孵箱中培养，24 h后，提取上清液和细胞蛋白，检测相关指标。

脂多糖预处理巨噬细胞24 h后，在96孔板中每孔加入10 μl（5 mg/ml）MTT溶液，于37 ℃孵箱中培养，4 h后取出，移除细胞上清液，每孔加入200 μl二甲基亚砜，放置于恒温摇床震摇10 min，于562 nm处测定OA值，检测相关指标。

Griess试剂盒取出，恢复至室温。将细胞上清液和标准品和加入到96孔板中，将试剂I 和试剂II 混匀加入96孔板中，避光，放置于恒温摇床震摇30 min，于470 nm处测定OA值，检测NO含量。

提前将ELISA试剂盒取出，恢复至室温。稀释细胞上清液，配置标准品工作液，按照ELISA试剂盒说明书要求依次加入反应液，最后加入终止液，于450 nm处检测OD值，计算IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α含量。

按照Trizol法提取巨噬细胞中总RNA，根据逆转录试剂盒说明书，进行RT-PCR反应。设定反应条件为：5 ℃预变性30 s，接着95 ℃变性6 s，最后60 ℃退火，延伸37 s，重复反应40个循环。RT-PCR引物设计见（表1）。以GAPDH为内参，利用2^−∆∆Ct方法分析结果。

脂多糖处理巨噬细胞24 h后，弃去细胞上层培养基，置于冰上，PBS洗涤3次，加入RIPA裂解液（含1%PMSF）反应30 min，离心，收集上清液。BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白含量，配置缓冲液，变性。每孔10 μl加入到10%预制胶中，设置电压200 V电泳30 min，设置电压25 V电转30 min，TBST洗涤，5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST洗涤，4 ℃一抗孵育过夜，TBST洗涤，二抗孵育30 min，TBST洗涤，加入曝光剂，曝光。

采用SPSS18.0分析实验中所涉及的数据，组间比较方差齐，用LSD检验，方差不齐采用 Dunnett’s T3检验，以P < 0.05为统计学差异，数据结果用均数 ± 标准误（$\bar x \pm s$）表示。

首先，观察益母草碱和脂多糖对巨噬细胞活力的影响（图1）。结果显示，脂多糖和益母草碱均能提高巨噬细胞的活力（P<0.05），当益母草碱与脂多糖共同刺激巨噬细胞时，巨噬细胞活力得到了进一步的增强（P<0.05）。

观察益母草碱对巨噬细胞炎症因子释放的影响，在脂多糖刺激下，巨噬细胞上清液中NO的释放增加，而益母草碱可以抑制巨噬细胞NO释放（图2A）。检测脂多糖对巨噬细胞上清液中IL-1β、IL-18和IL-6释放的影响，结果发现，益母草碱可以降低巨噬细胞IL-1β、IL-18和IL-6释放（图2B-2D）。结果显示，益母草碱可以减少脂多糖引起的巨噬细胞炎症因子的释放。

细胞内IL-1β、IL-18等炎症因子的释放需要经过NLRP3炎症小体的激活，为此，观察了益母草碱对NLRP3炎症小体激活的影响。RT-PCR结果显示（图3），脂多糖刺激后，NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表达增加，益母草碱可以降低mRNA表达。Western blot结果也证实益母草碱可以抑制脂多糖引起的巨噬细胞中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达（图4）。

应用RT-PCR检测益母草碱对巨噬细胞M1/M2表型的影响。正常情况下，巨噬细胞M1型标志物TNF-α和iNOS表达量较低，经脂多糖诱导刺激后TNF-α和iNOS的表达水平显著升高，益母草碱可以降低脂多糖引起的TNF-α和iNOS的mRNA表达（图5A和5B）。另一方面，脂多糖诱导刺激后，巨噬细胞M2型标志物Arg-1和CD206的表达水平降低，益母草碱预处理可以增加脂多糖引起的Arg-1和CD206表达（图5C和5D）。表明益母草碱可以调控脂多糖引起的巨噬细胞由M1向M2型转化。

研究发现在盆腔炎患者的上生殖道内存在大量激活的巨噬细胞^[8]。巨噬细胞是参与炎症反应的天然免疫细胞，当病原体入侵或者组织发生病变时，巨噬细胞分泌多种炎症因子，诱导更多的巨噬细胞活化、募集，加强局部抗炎作用。正常生理情况下，炎症因子的含量极少，具有维持机体免疫和调节心脑血管等功能^[9]。但当机体长期受到病原微生物、致炎因子刺激时，会导致一系列病理改变，如长期慢性子宫内膜炎刺激可以增加子宫纤维化的发病率^[10]。基于此，本实验利用革兰阴性菌来源的脂多糖刺激巨噬细胞，观察益母草碱对脂多糖诱导的巨噬细胞激活和炎症因子表达的影响。结果显示，脂多糖刺激可以引起巨噬细胞过度激活，相关炎症因子表达增加，益母草碱预处理可以减少炎症因子的表达和分泌，提示益母草碱的抗炎作用与抑制巨噬细胞中炎症因子的产生有关。

为了进一步阐明益母草碱的抗炎作用，本实验对NLRP3炎症小体进行了研究。大量研究发现脂多糖可以激活NLRP3炎症小体，引起细胞因子释放增加。鉴于盆腔炎是炎性刺激引起的病理变化，且抑制NLRP3炎症小体可以降低炎症，推测抑制NLRP3炎症小体过度激活可能对盆腔炎起到一定的治疗效果。本实验中发现，益母草碱可以通过抑制脂多糖引起的巨噬细胞中NLRP3炎症小体相关蛋白表达，从而减少炎症因子释放，证实益母草碱可以抑制脂多糖诱导的巨噬细胞内NLRP3炎症小体的过度激活发挥抗炎作用。

巨噬细胞的表型转化在盆腔炎的病理进程中发挥着重要作用，M1型巨噬细胞主要发挥促炎、吞噬病原体的作用，M2型巨噬细胞主要发挥促进组织重塑、损伤修复等。因此，在盆腔炎疾病中，M1型巨噬细胞能够加重上生殖道炎症进展，而M2型巨噬细胞能抑制疾病进展。为了明确脂多糖对巨噬细胞分化的影响，使用RT-PCR实验验证不同处理方式对巨噬细胞分型的影响。结果显示，脂多糖能够促进M1型标志物TNF-α和iNOS的mRNA表达，而益母草碱能明显抑制 TNF-α和iNOS的mRNA表达，同时促进M2型标志物Arg-1和CD206的mRNA表达。上述结果提示，益母草碱能抑制脂多糖诱导的巨噬细胞向M1型分化以及IL-18、IL-1β、TNF-α表达，促进巨噬细胞向M2型分化。

在炎症反应过程中，脂多糖可以引起巨噬细胞中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α等炎症因子表达增加，益母草碱可以通过抑制NLRP3炎症小体激活发挥其抗炎作用，提示抑制NLRP3炎症小体过度激活可能成为盆腔炎治疗的新策略，同时，本研究也为进一步开发益母草碱作为妇科用药提供理论基础。