Microbial transformation of Asiatic acid by Syncephalastrum racemosum CGMCC 3.2500

总状共头霉CGMCC 3.2500（中国普通微生物菌种保藏管理中心），4 ℃斜面保藏。

马铃薯培养基（PDA）：将200 g马铃薯去皮切块置于1000 ml蒸馏水中，煮沸1 h，用纱布过滤，加葡萄糖20.0 g，琼脂15.0 g，将滤液补足至1.0 L，分装，121 ℃、30 min灭菌后，将试管倾斜放置，冷凝后即得固体马铃薯培养基。液体培养基的制备不加琼脂，其余步骤同上。

DRX-600光谱仪（德国Rheinstetten公司）；Agilent 6538 VAD Accurate-Mass QTOF液质联用系统（美国安捷伦)；Agilent 1260高效液相色谱仪（含G1311C 1260 VL型四元泵、G1316A 1260柱温箱、G1315D 1260 VL型全波长扫描检测器、G1364C 1260 FC-AS，美国安捷伦），ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈色谱柱；氘代吡啶（剑桥同位素实验室）；积雪草酸（广西昌洲天然药业有限公司）。

将已经恢复培养的菌种接种至无菌的250 ml三角瓶（装有100 ml液体培养基）中，180 r/min、27 ℃下震荡培养72 h后取出，每瓶加入500 μl的积雪草酸乙醇溶液（4 mg/ml），相同条件继续培养10 d。设两组对照，一组接种微生物后只加入等体积的乙醇溶液（无底物）；另一组加入等量的底物到空白培养基中，在相同条件下培养。发酵完成后过滤菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，菌丝体用500 ml乙酸乙酯超声提取3次，每次30 min，合并乙酸乙酯萃取液及提取液，在60 ℃下真空浓缩至小体积，薄层色谱法（TLC）比较实验组与空白组的显色斑点，以氯仿/甲醇（9∶1）为展开剂，10%的硫酸乙醇溶液显色。

在10个1000 ml三角瓶中（每瓶装有400 ml培养基）以2%的接种量接入已恢复培养的总状共头霉CGMCC 3.2500菌种，置恒温振荡器中，180 r/min、27 ℃培养72 h后加入200.0 mg底物积雪草酸（溶于20 ml乙醇，每瓶加入2 ml），继续培养10 d。发酵完成后过滤菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯萃取液置旋转蒸发仪上浓缩至小体积，干燥，分别获得转化反应提取物0.4 g；转化反应提取物经凝胶柱纯化后，用半制备型高效液相色谱仪制备，流动相：甲醇/水/甲酸（60:40:0.05，V/V/V），流速3 ml/min，检测波长：210 nm，得到化合物1（10.5 mg，转化率5.25%）。

化合物1为白色固体粉末，高分辨质谱显示出[M-H]^-分子离子峰m/z 501.3240，结合¹H NMR谱和¹³C NMR谱推断确定分子式为C₃₀H₄₆O₆。¹H NMR（600 MHz, pyridine-d₅）中，高场处有6组甲基氢信号δ 1.47 (3H, s)、δ 1.18 (3H, s)、δ 1.03 (3H, d, 6.6)、δ 0.98 (3H, s)、δ 0.92 (3H, d, 6.0)、δ 0.82 (3H, s)；低场处有一活泼氢信号：δ 5.61 (t, 3.6)，推测为双键上的氢。¹³C NMR谱检测结果显示两个不饱和碳原子δ 127.04和δ 140.86，一个羧基碳原子δ 180.36，一个羰基碳原子δ 213.29，综合以上信息可以推断该化合物为乌苏烷型五环三萜酸类化合物。

依据¹H-¹³C HSQC谱（图1）、¹H-¹³C HMBC谱（图2）可以对该化合物的碳氢作进一步的归属。

与底物积雪草酸比较，在¹³C NMR谱中，213.29 ppm出现一个羰基碳信号，该羰基碳与H-1 (δ 2.58, d, 12.0)、H-3 (δ 5.08, s) 远程相关，说明C-2位的羟基被氧化成羰基。H-3 (δ 5.08, s)和C-3 (δ 78.14)的化学位移未发生显著变化，但是在¹H-¹H NOESY（图3）中，可以观察到H-3 (δ 5.08, s)和H-24 (δ 0.82)之间的NOE效应，说明3位的羟基构型发生了变化，由β构型转变为α构型。

在¹³C NMR谱中，68.12 ppm处出现一个连氧碳信号，在¹H NMR谱中，4.93 ppm(1H, dd, J=6.6, 9.6 Hz) 出现一个氢原子信号，二者在¹H-¹³C HSQC谱中可观察到相关信号。在¹H-¹³C HMBC谱中，可观察到H-27 (δ 1.47, s)、H-16 (δ 2.45, m)和δ 68.12的相关信号，说明15位发生了羟基化反应。同时H-15ax与H-16ax的耦合常数为9.6 Hz，确定该羟基为α型。

具体的¹H NMR 和¹³C NMR 数据及归属见表1。

综上，化合物1的结构确定为2-氧-3α,15α, 23-三羟基-12-烯-28-油酸（图4）。经文献检索，未发现与该化合物结构相同的报道，确定该化合物为新化合物。

积雪草酸是中药积雪草中的主要有效成分，具有多种生物活性^[9]。微生物转化具有专一性强、条件温和等优点^[10]。本研究通过总状共头霉CGMCC 3.2500对积雪草酸的生物转化，获得一个新化合物：2-氧-3α15α, 23-三羟基-12-烯-28-油酸。从催化反应的位置看，2位的羟基发生氧化生成了羰基，3位的羟基的立体结构由β变成α，15位发生羟基化反应。这些结构的变化由化学反应很难实现，也体现了生物转化高度的位置选择性和立体选择性。化合物1的转化率为5.25%，需要进一步优化转化条件，以提高转化效率。