Stability study and manufacture process optimization for Zhibai Anshen oral liquid

Agilent 1200系列高效液相色谱仪（Agilent，美国）；台式高速冷冻离心机（Eppendorf，德国）；CPA225D十万分之一天平（Sartorius，德国）；WL-901涡旋振荡混合器（其林贝尔仪器制造有限公司，海门）；SK7200H型超声仪（科导超声仪器有限公司，上海）；SHH-250SD药物稳定性试验箱（重庆永生实验仪器厂，温度：15～65 ℃，±2 ℃，湿度：15%～95%，±5%）。

知百安神口服液（中药材购自铜陵禾田中药饮片股份有限公司，口服液由海军军医大学长征医院制剂室制备）；芒果苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111607-201503，含量98.4%）；甲醇、乙腈、二氯甲烷为色谱纯试剂（Merck，德国）；甲酸为分析纯试剂（国药集团化学试剂有限公司）；水为纯净水。

色谱柱Agilent Eclipse XDB-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脱，洗脱程序见表1；检测波长为246 nm；流速1 ml/min；柱温30 ℃；进样量为5 μl。理论塔板数按芒果苷计算应不低于20 000。

取芒果苷对照品适量，精密称定，用70%乙醇溶液溶解并稀释制成每1 ml中含0.15 mg芒果苷的溶液。

精密量取知百安神口服液10 ml，用10 ml二氯甲烷萃取，震摇，静置，待完全分离。精密量取水相4 ml，加水定容至25 ml，经0.45 μm薄膜过滤，作为供试品溶液。

取芒果苷对照品适量，精密称定，用70%乙醇溶液溶解并稀释，制成每1 ml中含1.04 mg芒果苷的溶液，作为对照品母液，采用逐级稀释的方法，将芒果苷配制成208、156、104、78、52、26、10.4 μg/ml的对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，以峰面积对浓度进行线性回归分析，得回归方程为Y=16.56X−5.412（r=0.999 9），结果表明芒果苷在10.4～208 μg/ml范围内线性关系良好。

取“2.1.2”项下对照品溶液，重复进样6次，测定峰面积，计算得到芒果苷峰面积的RSD为0.24%，表明仪器精密度良好。

精密量取知百安神口服液（批号：120208）适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别放置0、2、4、8、12、24 h后进样测定，计算得到芒果苷含量的RSD为0.72%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

精密量取知百安神口服液（批号：120208）适量，按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定。计算得到芒果苷含量的RSD为1.18%，结果表明该方法重复性良好。

精密量取知百安神口服液（批号：120208）6份，每份5 ml，分别加入104 μg/ml的芒果苷对照品溶液各5 ml，混匀，按照“2.1.3”项下方法制备，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定。计算得芒果苷的平均加样回收率为99.47%，RSD为0.86%，表明该方法准确度良好。

水提醇沉法是广泛应用于中药的提取方法，其操作方法简单，生产成本低廉，更适合于规模化生产。本实验依据大生产实际情况对制备工艺采用正交设计，拟对中药水醇提取法影响较大的因素即提取加水量、提取时间、提取次数和醇沉浓度为影响因素进行考察，但参照文献^[5]发现，提取次数不适合加入到正交设计中，经过预实验结果并结合工艺化大生产能源等消耗考虑，确定提取次数为2次，可达到提取要求。因此，参照L₉(3⁴)设计正交试验，加水量为药材总量的6、10、12倍，提取时间为1、2、3 h，醇沉浓度为40%、60%、80%，以芒果苷的含量为检测指标，优选最佳提取工艺，见表2。

按处方称取各味药材共9份，按表2条件进行提取，按“2.1”项下方法进行含量测定，结果折合知百安神口服液芒果苷的含量（μg/ml），结果见表3。

从正交试验结果可以看出，A、B、C三因素影响大小排序为C>B>A，即醇沉浓度为最大影响因素，经过极差分析并结合能源成本和工业操作的简便有效性，确定最佳工艺为A₂B₁C₂，即10倍量水煎煮1 h，以60%醇浓度为醇沉浓度。

结合课题组前期研究和以上试验结果，知百安神口服液制备工艺的一般流程为：称取百合667 g、知母333 g，加10倍量水煎煮2次，每次1 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.24（50 ℃）的清膏，加入乙醇使含醇量达60%，4 ℃静置72 h，滤过，加单糖浆200 ml，加水至1000 ml，搅匀、煮沸、放冷、滤过、灌封、灭菌即得。

依据上述优化的工艺，于本院制剂室扩大生产，依据“2.1”项下芒果苷的测定方法对3批（批号：170406、180104、180713）中试产品进行测定，所测芒果苷的含量分别为780.9、657.7、621.0 μg/ml。

根据制剂稳定性试验指导原则（《中国药典》2020年版四部制剂通则9000）及口服溶液剂（《中国药典》2020年版四部制剂通则0123）有关规定，取3批知百安神口服液（批号：170406-1、170406-2、170406-3），在温度（40±2）℃、相对湿度（75±5）%的条件下放置6个月进行加速试验，于第0、1、2、3、6个月末分别取样，按稳定性重点考察项目检测。另取3批知百安神口服液（批号：170406、180104、180713），在温度（25±2）℃、相对湿度（60±10）%的条件下放置12个月进行长期试验，分别于第0、3、6、9、12个月取样，按稳定性重点考察项目进行检测。稳定性加速试验和长期试验结果提示，知百安神口服液在12个月内稳定。结果见表4、表5。

本课题组在前期研究工作中对知百安神口服液的质量标准进行了系统研究^[6]，笔者选取芒果苷作为工艺研究的指标及所用芒果苷的含量测定方法，即以前期研究工作为基础进行。

　　前期工作中发现，随着放置时间的延长，该口服液的pH值变化较大，发现原因是口服液瓶盖中的胶塞材质为天然橡胶，天然橡胶塞长时间与药液接触会对药液pH值产生影响，更换为硅胶塞后，稳定性试验结果显示口服液的pH值可保持稳定，本研究中采用的均为更换后的现行包装。

文献报道^[7]芒果苷可能受溶液pH值和温度的影响而不稳定，知百安神口服液的稳定性试验结果也证实了这点。从结果可以看出，芒果苷在水溶液的状态下，3个月内含量可稳定在10%以内，超过3个月会加速降解。《中国药典》2020年版对知母含量测定要求是检测芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量，但知母皂苷BⅡ需要应用蒸发光散射检测器检测，由于蒸发光散射检测器的检测误差较大，并不适用于制剂工艺考察。考虑到芒果苷是知百安神口服液的主要成分^[6]，且制剂工艺考察周期并不长（不超过1个月），芒果苷又利于快速便捷检测，因此，选择芒果苷作为指标成分，优化知百安神口服液的提取工艺，而利用稳定性考察结果制订制剂的有效期则需考察多种检验因素，还需进一步研究。