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辅酶Q10（CoQ10）是生物体内广泛存在的脂溶性醌类化合物，作为细胞中的辅酶，其具有重要且广泛的药理作用[1]，目前主要用于预防心血管疾病和增强免疫力等方面[2-4]。CoQ10分子量高、水溶性低，口服生物利用度低，注射剂稳定性差，对光十分敏感[5]，越来越多的研究表明静脉注射乳剂是其理想载体[6]。
高油量可溶解更大量药物，对极难溶性药物的优势更为明显。但是目前对于含药静脉注射乳剂的研究中，油的质量体积比通常为10%[7]，更高油量的研究相对较少。基于营养型脂肪乳剂的长期临床应用实践，高油量静脉注射乳剂的安全性已得到证实，具有广阔的发展空间和巨大的市场价值。同时乳剂不能经受冷冻也长期困扰着研究者们，卵磷脂与含亲水链段的乳化剂组合及恰当的油黏度是解决此问题的关键。本研究在乳剂经典处方中添加单唾液酸四己糖神经节苷脂（GM1），GM1含有一个较大的亲水头基，具有两亲性，利用其特殊的结构优势来解决乳剂不耐受冻融的难题。本研究旨在制备高油量、高载药量且耐冻融循环的CoQ10乳剂，建立其HPLC含量分析方法，并进行物理化学性质表征和稳定性评价，以弥补CoQ10现有制剂的不足，为高油量含药静脉注射乳剂的研究开发提供参考依据。
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BS124s电子分析天平（德国Sartorius公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；高速分散机（德国IKA T18 ULTRA TURRAX）；M-110L型微射流仪（美国Microfluidics公司）；垂直旋转自动高压灭菌器（沈阳天美达科学仪器有限公司）；Nicomp-380 激光粒度测定仪（美国Particle Sizing Systems公司）；PHS-2C型数字显示酸度计（上海伟业仪器厂）；CS120GXL型超速离心机（日本Hitachi公司）；UV228紫外-可见光检测器、P230高压恒流泵（大连依利特分析仪器有限公司）；高精度全自动交流稳压器（浙江中川电气科技有限公司）；AT-130柱温箱（天津市金洲科学仪器有限公司）；人工气候箱（德国MMM公司）。
CoQ10（广东润和生物科技有限公司，批号：2017052405，纯度
$\geqslant $ 98%），中链油（MCT，辽宁铁岭北亚药用油有限公司，注射级），大豆油（LCT，辽宁铁岭北亚药用油有限公司，注射级），蛋黄卵磷脂（E80，德国Lipoid公司，注射级），GM1（重庆寰瑞生物制药有限公司，注射级），维生素E（VE，BASF维生素有限公司），甘油（湖南尔康制药有限公司，注射级），聚乙二醇12-羟基硬脂酸酯（HS15，德国BASF公司，注射级），葡萄糖注射液（昆明南疆制药有限公司），氯化钠注射液（吉林省都邦药业股份有限公司），灭菌注射用水（石家庄四药有限公司），其他试剂均为色谱纯。 -
油种类对乳剂的稳定性至关重要，LCT和MCT单独应用时均存在各自的缺陷，且乳剂不能经受冷冻，因此将二者联合应用，质量比为1∶1[8]。结合静脉注射乳剂经典处方组成，CoQ10乳剂按如下方法制备[9]。称取质量体积比为30% LCT/MCT (质量比1∶1)、2% E80、0.05% VE和2% CoQ10于60 ℃水浴中加热熔融、分散均匀。2.25%甘油和0.2% GM1溶解于适量重蒸水中，60 ℃加热搅拌至完全溶解。待两相温度平衡后，高剪切搅拌下（8000 r/min）将水相加入油相中，完全加入后继续分散5 min，即得初乳。待初乳冷却至室温后，加重蒸水定容至处方量。将初乳转移至微射流仪中，经6 000 psi均质3个循环，14 000 psi均质6个循环减小粒径。依次过0.80和0.45 μm微孔滤膜。将所得乳剂分装，充氮气，121 ℃灭菌8 min。
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色谱柱：Betasil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm，大连依利特）；流动相：甲醇-无水乙醇（体积比20∶80）；柱温：35 ℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：275 nm；进样量：20 μl。
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精密称定CoQ10 25.0 mg，置于25 ml量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1000.0 μg/ml的CoQ10对照品储备液。精密移取CoQ10乳剂0.1 ml，置于10 ml量瓶中，加入无水乙醇破坏乳剂并稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得CoQ10乳剂样品溶液。
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取CoQ10乙醇溶液20 μl进样，记录色谱图。将空白乳和CoQ10乳剂分别加适量无水乙醇破乳，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取各续滤液20 μl进样，记录色谱图。在此色谱条件下辅料和溶剂对药物测定无干扰，见图1。
图 1 空白乳剂（A）、CoQ10溶液（B）和CoQ10乳剂（C）的HPLC图
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精密量取CoQ10对照品储备液适量，用无水乙醇稀释成浓度为10.0、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0 μg/ml的系列标准溶液，过0.45 μm微孔滤膜，各取20 μl进样分析，记录峰面积A。以A对浓度C（μg/ml）进行线性回归，得线性方程为A=15738 C- 12584，r=0.999 8。结果表明CoQ10在10.0 ~ 250.0 μg/ml范围内线性关系良好。
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分别取低、中、高浓度（25.0、100.0、200.0 μg/ml）的CoQ10对照品溶液，于2、4、6、8、10 h各测定一次，以峰面积求算日内精密度；于1、2、3、4、5天各测定一次，以峰面积求算日间精密度。结果表明RSD均小于2%，方法精密度良好。
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取“2.2.2”项下CoQ10乳剂样品溶液室温下避光放置，于0、2、4、6、8、10、24 h分别取20 μl进样分析，记录峰面积。计算得各时间点峰面积为0 h测定值的100.45%、101.23%、99.27%、100.26%、99.34%及100.06%，表明样品溶液在24 h内稳定。
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按“2.2.2”项下方法平行制备6份CoQ10乳剂样品溶液。另精密称定CoQ10适量，加乙醇溶解并稀释成浓度为200.0 μg/ml的溶液，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得对照品溶液。精密量取样品和对照品溶液20 μl进样，记录峰面积。外标法计算得样品中药物浓度分别为201.3、199.6、198.2、200.7、199.2、198.4 μg/ml，RSD为0.62%，表明该方法重复性良好。
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精密移取CoQ10对照品储备液0.25、1.0和2.0 ml各3份于10 ml量瓶中，分别加入0.1 ml空白乳，再加乙醇破坏乳剂并稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜。将上述各溶液进样分析，记录峰面积，按“2.2.4”项下标准曲线方程求得药物浓度，计算回收率。结果表明25、100和200 μg/ml CoQ10样品溶液的平均回收率分别为100.04%、99.63%和100.49%，RSD分别为0.29%、0.80%和0.52%。
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按照“2.1”项下的处方工艺制备CoQ10乳剂，观察其外观。CoQ10乳剂外观为淡黄色均匀乳状液体，无油滴、不溶性成分或块状团聚物，见图2。
图 2 CoQ10乳剂的外观
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取CoQ10乳剂适量，用蒸馏水稀释至适宜浓度，采用激光散射粒径测定仪测定3批CoQ10乳剂的粒径、粒径分布和Zeta电位。测定波长为632.8 nm，测定角为90°，测定温度为25 ℃。结果显示3批样品的平均粒径为（239.5±0.8）nm，未见大于5 μm的粒子，符合静脉注射液的要求；粒径为（0.300±0.011）nm；Zeta电位为（−32.28±2.04）mV。同时测定了CoQ10乳剂的pH值为（5.86±0.02），符合注射剂质量要求。
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精密量取CoQ10 乳剂0.1 ml（含CoQ10约2 mg）于10 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取20 μl进样，记录色谱图。另取相同浓度的药物溶液，同法测定。外标法计算乳剂中CoQ10的含量，最终测得3批供试品的标示量百分比分别为99.18 %、101.50 %和101.08%，RSD为1.24%。
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采用超速离心法测定CoQ10乳剂的包封率。乳剂经过超速离心后，油相、乳化层和水相彻底分开，将油相与乳化层中的药物量合并考虑，通过测定水相中的药物量来计算包封率。精密移取CoQ10乳剂0.1 ml至10 ml量瓶中，加入乙醇稀释至刻度，混匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液进行HPLC检测，外标法计算药物总量。移取CoQ10乳剂4 ml至超速离心管中，温度为4 ℃，以50 000 r/min离心2 h。精密移取下层液体1.0 ml至10 ml量瓶中，乙醇稀释至刻度，混匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液进行HPLC检测，外标法计算水相中药物含量。按上述方法测得3批CoQ10乳剂的平均包封率为（98.5%±1.1）%，表明药物绝大部分存在于制剂的油相和油水界面层中。
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将CoQ10乳剂分装于西林瓶，充氮气密封，121 ℃灭菌8 min。参考《化学药物稳定性研究技术指导原则》中涉及乳剂冻融试验的方法，将灭菌后样品在−20 ℃冷冻48 h，40 ℃放置48 h为一个循环，共循环3次，每完成一个循环测定粒径。结果显示3批CoQ10乳剂均具有良好的灭菌稳定性和冻融稳定性，见表1。
表 1 CoQ10乳剂的灭菌和冻融试验结果
批次 粒径（l/nm） 灭菌前 灭菌后 冻融1次 冻融2次 冻融3次 1 241.4 239.6 255.7 263.0 271.2 2 238.5 240.0 252.6 265.9 272.3 3 240.2 238.7 259.0 263.5 269.1 -
以平均粒径和粒径分布为指标，考察CoQ10乳剂在5%葡萄糖注射液和0.9%氯化钠注射液中的稀释稳定性。将制剂用上述稀释介质进行50倍稀释，于0、2、4、6、8、10、12、24 h取样，测定粒径和粒径分布。结果见图3，制剂经5%葡萄糖注射液和0.9%氯化钠注射液稀释后放置24 h，粒径和粒径分布均比较稳定，稀释稳定性良好。
图 3 CoQ10乳剂用5%葡萄糖和0.9%氯化钠注射液稀释50倍后粒径和粒径分布的变化（n=3）
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CoQ10结构中含有大量不饱和双键，是典型的光敏性药物。以药物含量为主要指标，考察不同因素对CoQ10乳剂光解速率的影响。将样品分装于透明西林瓶，置于人工气候箱中，于（25±2） ℃、（4500±500）lux条件下进行强制光解试验，调整样品与光源的距离约10 cm，使受光均匀，分别于0、24、48、72、96、120 h取样，HPLC法测定药物含量。绘制光降解曲线，并进行反应级数拟合，求出光解半衰期（t1/2）。
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将适量CoQ10用无水乙醇溶解并稀释，即得CoQ10溶液。称取0.25% CoQ10和3% HS15于55 ℃水浴中加热熔融，分散均匀。搅拌状态下加入预热至相同温度的注射用水，搅拌10 min，即得CoQ10胶束。制备相同药物浓度（1 mg/ml）的CoQ10溶液、胶束和乳剂进行光解试验。光解曲线见图4，反应级数均为一级。对CoQ10的光保护作用由强到弱依次为乳剂、胶束和溶液，t1/2分别为239.0、50.6和29.4 h。
图 4 CoQ10乳剂、胶束和溶液的光降解曲线（n=3）
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将CoQ10乳剂（20 mg/ml）分别稀释0、2、4、10、20倍进行光解试验。光解曲线见图5，反应级数均为一级，稀释倍数由低到高，t1/2分别为533.1、495.0、288.8、115.5和62.4 h。
图 5 不同稀释倍数CoQ10乳剂的光降解曲线（n=3）
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分别制备0.1%（1 mg/ml）和2.0%（20 mg/ml）载药量的CoQ10乳剂，进行光解试验。光解曲线见图6，反应级数均为一级，0.1%和2.0%载药量乳剂的t1/2分别为233.5和533.1 h。结果表明，光解速率与载药量呈反比，载药量越大，光解速率越小。
图 6 不同载药量CoQ10乳剂的光降解曲线（n=3）
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CoQ10乳剂需在冰箱（2~8 ℃）内储存，因此以下稳定性实验参照《中国药典》2020版中对温度特别敏感药物制剂的实验条件进行。
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将CoQ10乳剂分装于棕色西林瓶中，充氮气、密封，在（25±2） ℃、（4 500±500） lux条件下，于第0、5、10天取样，以制剂外观、含量、粒径、pH为评价指标，考察CoQ10乳剂的光照稳定性。结果(见表2)表明3批制剂的含量和pH略有下降，提示该乳剂需避光制备与储存。
表 2 CoQ10乳剂的光照稳定性试验结果
天数（t/d） 外观 含量（%） 粒径（l/nm） pH 0 良好 100.4 243.2 5.82 5 良好 97.7 239.8 5.79 10 良好 93.6 241.4 5.70 -
将CoQ10乳剂分装于西林瓶中，充氮气、密封，在（40±2） ℃条件下避光放置，于第0、5、10天取样，以制剂外观、含量、粒径、pH为评价指标，考察CoQ10乳剂在高温条件下的稳定性。结果(见表3)显示3批制剂的含量和pH随时间延长呈下降趋势。
表 3 CoQ10乳剂在40 ℃的稳定性试验结果
天数（t/d） 外观 含量（%） 粒径（l/nm） pH 0 良好 100.4 243.2 5.82 5 良好 100.2 245.2 5.57 10 良好 99.5 245.0 5.21 -
取3批CoQ10乳剂分装于西林瓶中，充氮气、密封，在（25±2） ℃、相对湿度60%的条件下避光放置6个月，分别于第0、1、2、3、6个月取样，观察制剂外观，测定含量、粒径和pH值。结果表明，CoQ10乳剂在（25±2） ℃条件下避光放置6个月，各指标均在合格范围内，稳定性良好。
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取3批CoQ10乳剂分装于西林瓶中，充氮气、密封，在（5±3） ℃条件下避光放置12个月，分别于第0、3、6、9、12个月取样，观察制剂外观，测定含量、粒径和pH值。结果表明，CoQ10乳剂在（5±3） ℃条件下避光放置12个月，各指标均在合格范围内，稳定性良好。
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乳剂冷冻期间冰晶的形成会破坏乳化膜，从而引发小油滴聚集成大油滴，甚至导致浮油、破乳。解决乳剂冻融问题的主要手段为油相和乳化剂的合理选择。其一是油相要有恰当的黏度，将LCT与MCT联合应用既能克服单独使用存在的问题，又可取长补短，有利于乳剂冻融稳定性的提高。其二，牢固的乳化膜可增强乳剂的冻融稳定性，有研究[11]发现卵磷脂与含亲水链段的乳化剂组合对提高冻融稳定性有至关重要的作用。本实验CoQ10乳剂处方组成中的GM1是一种内源性糖脂，具有生物可降解、无免疫原性等特点[12]，近年来已有研究将GM1应用于乳剂、脂质体和胶束的制备[12-14]。GM1是两亲性物质，可与卵磷脂形成复合乳化膜，增加膜的韧性。其结构中的较大亲水头基形成的空间立体位阻，及结构中唾液酸的荷负电对提高乳剂的冻融稳定性也至关重要。此外，在水相中加入含羟基的醇类或糖类（冻融保护剂），可以增加水相黏度，减慢冰晶的生长速度和程度，增强乳剂的冻融稳定性。
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CoQ10的光解具有浓度依赖性，起始浓度高时光解速率相对较慢，但当制剂稀释倍数增加时，其透光性大大增加，光解反应加剧。对于微粒给药系统，粒径是一个重要参数，同时其光解具有一定的粒径依赖性。本研究所制备的乳剂属于高油量低磷脂含量，与普通乳剂相比粒径较大，因此光稳定性要更好。推测原因为光不容易穿透大粒径制剂的内部，降低了药物的曝光率；此外，粒径大时粒子的曲率较低，比表面积小，因此曝光机会少，越不易光解[10]。本实验证明了将CoQ10包封入乳剂中可减少其曝光机会，对药物能起到一定的保护作用。但CoQ10乳剂仍需低温氮气环境下保存，使用过程中避光处理，以减少光解的概率。
The improvement of formulation process and quality evaluation of coenzyme Q10 emulsion
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摘要:
目的 对处方工艺改进的辅酶Q10乳剂进行质量评价，并建立其含量测定方法。 方法 制备高油量辅酶Q10乳剂，利用HPLC建立其含量测定与有关分析方法，并进行理化性质表征，测定包封率，考察灭菌、冻融和稀释稳定性，进行强光降解试验以及影响因素、加速和长期试验。 结果 辅酶Q10乳剂粒径、Zeta电位、pH值、含量和包封率分别为（239.5±0.8）nm、（−32.28±2.04）mV、（5.86±0.02）、（100.59±1.24）%和（98.5±1.1）%，灭菌、冻融和稀释稳定性均良好。乳剂光解速率与稀释倍数呈正比，与载药量呈反比。辅酶Q10乳剂需避光制备、低温储存；（40±2） ℃避光放置10天，pH值下降0.61；加速和长期试验稳定性良好。 结论 高油量辅酶Q10乳剂符合静脉注射液的质量要求，稳定性良好。 Abstract:Objective To evaluate the quality of coenzyme Q10 emulsion with improved formulation and technology and establish an assay method. Methods Coenzyme Q10 emulsion with a high oil concentration was prepared and analyzed by HPLC. The physical and chemical properties of the emulsion were characterized, and the entrapment efficiency was determined. The stability of sterilization, freeze-thaw and dilution was investigated. The photodegradation test as well as the influencing factors, acceleration and long-term stability tests were carried out. Results The particle size, Zeta potential, pH value, content and entrapment efficiency of coenzyme Q10 emulsion were (239.5±0.8) nm、(−32.28±2.04) mV、(5.86±0.02)、 (100.59±1.24) % and (98.5±1.1) %, respectively. The stability of sterilization, freeze-thaw and dilution was good. The photolysis rate was directly proportional to the dilution ratio and inversely proportional to the drug loading. Coenzyme Q10 emulsion should be prepared in light free environment and stored at a low temperature. The pH value dropped 0.61 when it was kept in darkness at (40±2) ℃ for 10 days. It exhibited good stability both in the accelerated and long-term test. Conclusion The physicochemical properties of coenzyme Q10 emulsion with a high oil concentration meet the quality requirements for intravenous injection with good stability. -
Key words:
- high oil content /
- coenzyme Q10 /
- emulsion /
- physicochemical property /
- stability
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表 1 CoQ10乳剂的灭菌和冻融试验结果
批次 粒径（l/nm） 灭菌前 灭菌后 冻融1次 冻融2次 冻融3次 1 241.4 239.6 255.7 263.0 271.2 2 238.5 240.0 252.6 265.9 272.3 3 240.2 238.7 259.0 263.5 269.1 
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表 2 CoQ10乳剂的光照稳定性试验结果
天数（t/d） 外观 含量（%） 粒径（l/nm） pH 0 良好 100.4 243.2 5.82 5 良好 97.7 239.8 5.79 10 良好 93.6 241.4 5.70
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表 3 CoQ10乳剂在40 ℃的稳定性试验结果
天数（t/d） 外观 含量（%） 粒径（l/nm） pH 0 良好 100.4 243.2 5.82 5 良好 100.2 245.2 5.57 10 良好 99.5 245.0 5.21
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