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在我国成人死因中，脑卒中位列第一，全球第二[1-2]。在所有的脑卒中患者中，有78%的患者是缺血性脑卒中，其他为出血性脑卒中[3]。脑卒中的治疗药物很少，目前FDA唯一批准的药物只有组织纤溶酶原激活剂。但是，由于其治疗窗口狭窄、有禁忌证和并发症风险，组织纤溶酶原激活剂仅适用于3%～5%的脑卒中患者[2]。因而，寻求新的治疗靶点和手段显得十分重要。
烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)又被称作内脏脂肪素，也是一种脂肪因子。它还有一个名称是PBEF，是合成哺乳动物细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的关键限速酶[4]。最近的研究证明了Nampt可以作为缺血性脑卒中治疗新靶点[2-3,5-7]。Nampt治疗缺血性脑卒中的作用机制包括急性期的脑保护以及慢性期的促血管修复和神经再生作用。这些作用机制通过体内体外试验在神经细胞、内皮祖细胞和神经干细胞得到证实。NAD+在细胞能量维持中起着关键作用[8]，而Nampt可以通过补救合成途径促进哺乳动物中NAD+生物合成，影响ATP的产生，对抗缺血性脑卒中后的供能不足，维持细胞内能量稳态，抑制神经细胞死亡[3]。
Nampt既可存在于细胞内，也可以分泌到细胞外[9]。从细胞分泌出来后可以存在于血液中，与高血压、糖尿病等多种疾病相关[10,11]。在缺血性脑卒中发生后，外周血液的Nampt会显著性升高[12-13]。局部脑组织内Nampt对缺血性脑卒中的保护作用已经十分明确，而脑外组织来源的Nampt对缺血性脑卒中的作用研究较少。已知肝脏细胞可以分泌Nampt，并且肝脏被认为是血液Nampt的主要组织来源之一[3,14-15]。本研究主要通过Cre/loxP重组酶系统特异性敲除肝脏Nampt基因的表达，利用大脑中动脉阻塞(MCAO)缺血性脑卒中模型，研究肝脏来源的Nampt是否参与缺血性脑卒中的保护，为进一步明确Nampt作为缺血性脑卒中治疗新靶点的重要意义，为探究外周器官参与缺血性脑卒中损伤及修复的新机制打下基础。
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NamptloxP/loxP小鼠(南京医科大学王强教授实验室赠予)和Albumin-Cre小鼠(上海南方模式生物科技发展有限公司)。动物自由饮水、进食；环境温度控制在(25±1) ℃，相对湿度40%～60%，昼夜均为12 h。所有动物实验均符合实验动物伦理学要求。
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PCR仪(TaKaRa)，M200 PRO多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)，SC12型水平电泳槽(北京凯元信瑞仪器有限公司)，FR-980A生物电泳图像分析系统(上海复日科技有限公司)，红外激光扫描成像系统(LI-COR)，蛋白电泳、转膜系统(上海天能科技有限公司)，高通量组织研磨仪(上海万柏生物科技有限公司)，颅骨钻(广州坤图生物科技有限公司)，CHR多功能手术仪(武汉春光医疗美容仪器有限公司)。
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小鼠鉴定引物(上海生工生物工程股份有限公司)序列如表1所示。
表 1 基因型鉴定引物
序号 引物序列(5’-3’) 鉴定基因型 条带位置 引物1 野生型上游引物:
TGCAAACATCACATGCACAC
通用型下游引物:
TTGGCCCCTTACCATAACTG
突变型上游引物:
GAAGCAGAAGCTTAGGAAGATGGNamptloxP/loxPAlb-Cre 150 bp
351 bp
390 bpNamptloxP/loxP 351 bp 引物2 下游引物:
TTCCAGGCTATTCTGTTCCAG
上游引物:
TCTGGCTCTGTGTACTGCTGANamptloxP/loxP 300 bp 鼠尾基因组DNA提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)，多聚甲醛(博光生物科技有限公司)，GAPDH抗体和BCA蛋白浓度试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，PBEF抗体(F-8)(Santa Cruz Biotechnology)，Premix TaqTM (TaKaRa)，硝酸纤维素转移膜(Whatman)，IRDye®800CW Donkey anti-Mouse IgG二抗(LI-COR)，血浆Visfatin 检测试剂盒(Phoenix Pharmaceuticals, Inc)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(BBI Life Science)，异戊巴比妥(BIOSZUNE LIFE SCIENCES DEP)，水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)。
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白蛋白(Alb)仅在肝脏中表达。目前，Alb基因启动子作为肝脏特异性启动子被广泛用于制备肝脏特异性基因敲除小鼠模型[16]。NamptloxP/loxPAlb-Cre及其同窝对照NamptloxP/loxP小鼠由NamptloxP/loxP和Alb-Cre两种小鼠杂交获得。培育过程如图1：①将NamptloxP/loxP 小鼠与Alb-Cre小鼠交配，筛选获得NamptloxP/WTAlb-Cre，②NamptloxP/WTAlb-Cre与NamptloxP/loxP小鼠交配，得到NamptloxP/loxPAlb-Cre，③最后将NamptloxP/loxPAlb-Cre与NamptloxP/loxP交配，得到用于实验的NamptloxP/loxPAlb-Cre(即liver-specific Nampt knockout mice，以下简称LNKO)及其同窝对照NamptloxP/loxP小鼠(以下简称WT)，用引物1对其子代进行基因型鉴定。实验中①②③交配使用的NamptloxP/loxP 小鼠全部用NamptloxP/loxP与NamptloxP/loxP小鼠交配所得，用引物2对其子代进行基因型鉴定。
图 1 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠的培育
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剪取5周龄小鼠尾巴约0.5 cm。置于1.5 ml离心管中，剪碎后，按照鼠尾基因组DNA提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)说明书进行提取。
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扩增小鼠DNA，扩增程序如图2，扩增体系20 μl：Premix TaqTM 10 μl，引物1 μl (5 μm)，DNA溶液2 μl，ddH2O体积为7 μl，混合均匀后放入PCR仪进行扩增。NamptloxP/loxPAlb-Cre与NamptloxP/loxP交配得到的子代用引物1和扩增程序图2A进行鉴定，NamptloxP/loxP 与NamptloxP/loxP交配得到的子代，理论上都为NamptloxP/loxP，用引物2和扩增程序图2B进行鉴定。
图 2 鼠尾DNA PCR鉴定扩增程序
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配制2%的琼脂糖凝胶(琼脂糖凝胶未凝固前每10 ml加入1 μl的gelRed试剂)，在水平100 V电泳槽中电泳30 min。
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最后用生物电泳图像分析系统，在312 nm紫外线下拍摄成像。
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用1%异戊巴比妥腹腔麻醉小鼠(100 mg/kg)，心脏取血后，取出小鼠的肝脏、脑，用高通量组织研磨仪对组织进行匀浆，在4 ℃，12 000×g的条件下，离心20 min后取上清液，用BCA法进行蛋白定量，通过蛋白免疫印迹法检测Nampt蛋白。
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用4%水合氯醛腹腔麻醉小鼠(400 mg/kg)，将小鼠固定在鼠板上，剔除左眼周围的毛发后，酒精棉球消毒，用镊子揪起左耳外耳道和左眼外眦之间的皮，平行于下层肌肉表面做1 cm切口，分离头骨外周肌肉，用颅骨钻在颞骨前下紧邻颧弓前上缘的部位打磨使颞骨变薄，用镊子去除部分头骨，在手术显微镜下找到大脑中动脉，并用电凝器凝断位于嗅束至大脑下静脉之间的主干，再缝合伤口。术后将小鼠置于保温毯上，待清醒后放回动物笼内饲养。
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神经行为学损伤评分采用5分法[17]。0分：正常，无神经功能缺损；1分：瘫痪侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损；2分：行走时，小鼠向瘫痪侧转圈，中度神经功能缺损；3分：行走时，小鼠身体向瘫痪侧倾倒，重度神经功能缺损；4分：不能自发行走，有意识丧失。
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MCAO造模24 h后将小鼠麻醉，断头取出脑，放入−20 ℃冷冻15～20 min，再用刀片将全脑冠状切出6片1 mm厚的脑片，去掉尾部带有嗅球、小脑和低位脑干的部分。脑片用37 ℃预热的2% TTC染色，37 ℃避光染色30 min，正常组织为红色，梗死组织为白色。4％多聚甲醛固定1 h后，用滤纸吸干液体再取出脑片，用扫描仪扫描脑片，用Image J计算梗死面积，以测量梗死脑组织体积占总测量脑片体积的百分比作为衡量脑梗死的指标。每片切片的脑梗死体积=(该切片双面梗死面积之和÷2)×层厚，相对脑梗死体积(%)=(全部切片梗死体积之和÷全部切片体积之和)×100%。
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小鼠心脏取血得到血浆后，用ELISA法测定Nampt的含量。测定步骤按照血浆Visfatin 检测试剂盒说明书进行。
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采用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行统计分析，实验数据用(
$ \stackrel{-}{x} $ ±s)表示，通过独立样本t检验分析组间差异的显著性，以P<0.05为具有统计学差异。 -
核酸电泳条带为150 bp+351 bp+390 bp的为NamptloxP/loxPAlb-Cre，即LNKO小鼠，核酸电泳条带为351 bp的为NamptloxP/loxP，即WT小鼠。小鼠基因型鉴定结果如图3所示，从左到右，泳道1为DNA Maker，泳道2和3为WT小鼠(351 bp)，泳道4和5为LNKO小鼠(150 bp+351 bp+390 bp)。
图 3 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠鉴定电泳图
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比较各组小鼠12周龄的体重。如图4所示，WT雄性小鼠的体重为(25.31±1.91) g，LNKO雄性小鼠的体重为(25.19±1.17) g，WT雌性小鼠的体重为(19.79±1.19) g，LNKO雌性小鼠的体重为(20.36±1.79) g。同一性别中，LNKO和WT小鼠体重比较没有显著性差异。WT小鼠中，雄鼠比雌鼠平均重5.52 g(P<0.001)。LNKO小鼠中，雄鼠比雌鼠平均重4.83 g (P<0.001)。以上结果说明特异性敲除肝脏Nampt基因表达，对小鼠的体重无影响。
图 4 12 周龄肝脏特异性 Nampt 基因敲除小鼠体重情况(n≥7)
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为进一步验证成功培育肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠，提取各组小鼠的肝脏和脑组织蛋白，通过蛋白免疫印迹验证两种组织中Nampt蛋白的表达。如图5A所示，同一性别肝脏组织中，LNKO小鼠Nampt蛋白表达水平都显著性低于其对照WT小鼠，其中LNKO雄性小鼠Nampt蛋白表达水平比WT雄性小鼠降低了67.1%；LNKO雌性小鼠Nampt蛋白表达水平比WT雌性小鼠降低了81.3%。如图5B所示，在脑组织中，LNKO小鼠Nampt蛋白表达水平与其对照小鼠相比无显著性差异。蛋白免疫印迹结果进一步证明，肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠被成功构建。
图 5 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠肝脏、脑组织中Nampt蛋白的表达(n=3)
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根据血浆Visfatin检测试剂盒的数据处理方法，测量Nampt蛋白的标准品(浓度依次为0.1、1、10、100、1000 ng/ml)在450 nm处的吸光度（A）值，对数据进行四参数Logistic曲线拟合得到图6A，R2=1，曲线拟合效果很好。
图 6 生理条件下肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠血浆Nampt蛋白表达(n≥6)
根据拟合曲线方程和样品的吸光度值，计算各组小鼠血浆Nampt蛋白浓度。如图6B所示，同一性别对应的LNKO与WT小鼠血浆Nampt蛋白浓度无显著性差异，LNKO与WT小鼠的血浆Nampt蛋白浓度也无显著性差异。只有LNKO雄性组的血浆Nampt蛋白平均浓度比LNKO雌性组略升高0.91 ng/ml(P<0.05)。
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MCAO造模43只小鼠，成功造模38只，其中WT雄性小鼠11只，LNKO雄性小鼠8只，WT雌性小鼠11只，LNKO雌性小鼠8只，造模成功率为88.37%。
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图7A显示各组典型脑片TTC染色，白色是梗死区。图7B代表统计后各组相对脑梗死体积。MCAO造模24 h后，相对脑梗死体积数据如下：WT雄性组为(16.14±1.78)%，LNKO雄性组为(17.71±2.08)%，WT雌性组为(16.85±3.36)%，LNKO雌性组为(18.68±4.50)%。各组在MCAO 造模24 h后的相对脑梗死体积无显著性差异。
图 7 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠MCAO造模24 h后脑梗死情况(n≥8)
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神经行为学损伤评分数据如表2所示。造模24 h后，各组小鼠以轻度神经功能损伤为主，瘫痪侧前肢不能完全伸展；每组都存在部分发生中度神经功能损伤，行走时向瘫痪侧转圈。各组在MCAO造模24 h后神经行为学评分无显著性差异，而且各组神经行为学评分高低与相对脑梗死体积一致。
表 2 各组小鼠MCAO造模24 h后神经行为学损伤评分 (n≥8)
组别 神经行为学损伤评分(分) WT雄性组 1.20±0.42 LNKO雄性组 1.50±0.71 WT雌性组 1.32±0.56 LNKO雌性组 1.63±0.69 WT组 1.26±0.49 LNKO组 1.56±0.68 WT: 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠同窝对照；LNKO: 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠。 -
MCAO造模24 h后，各组血浆Nampt蛋白平均浓度：WT雄性组为(6.26±0.98) ng/ml，LNKO雄性组为(6.44±1.03) ng/ml，WT雌性组为(5.28±0.86) ng/ml，LNKO雌性组为(5.70±0.80) ng/ml。如图8所示，LNKO及其同窝对照WT小鼠在MCAO造模24 h后血浆Nampt蛋白表达无显著性差异。
图 8 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠MCAO造模24 h后血浆Nampt蛋白表达(n≥6)
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本研究利用Cre/loxP重组酶系统成功构建肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠，并证实肝脏来源Nampt对缺血性脑卒中没有明显保护作用。
Cre/loxP重组酶系统介导的基因打靶方法是目前应用最为广泛的基因条件性敲除方法。 loxP序列中的特殊回文结构可以被Cre酶特异性识别结合并催化两个loxP序列之间的片段发生同源重组，进而实现对该片段的基因敲除。我们通过基因鉴定和肝脏Nampt蛋白免疫印迹从基因和蛋白两个层面对该动物模型进行验证，结果都表明小鼠肝脏Nampt基因被特异性敲除。以同窝对照为阴性对照，监测两组小鼠的一般状况，发现其体重、活动状态等无显著差异。有研究曾比较10、55、110周雌性肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠与对照小鼠体重，两者无显著性差异，这与本研究结果一致[16]。
Nampt是一种脂肪细胞因子，可由脂肪组织大量分泌。除此以外，其他如肝细胞，白细胞，单核细胞，B细胞，心肌细胞和各种神经细胞也可分泌Nampt，目前认为脂肪、肝脏和白细胞是血液Nampt来源的主要器官[3]，但是血液中Nampt的各组织分泌的贡献率并不是十分清楚。本研究首次显示特异性敲除小鼠肝脏Nampt基因的表达并不能显著影响生理情况下血浆Nampt蛋白浓度，这是基于肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠的一个在体研究结果，不同于前期的相关研究。前期研究报道了肝脏HepG2细胞[15]、大鼠来源肝细胞[14-15]和原代人的肝细胞[15]可以大量分泌Nampt蛋白，这些结论主要基于的都是体外的细胞实验，没有研究整体的动物和人。本研究结果说明生理状态下肝脏Nampt的分泌水平可能相对较低，对血液Nampt的贡献率不如脂肪组织。肝脏特异性Nampt基因敲除导致的Nampt分泌减少在生理状态下可能仍然能够被脂肪等组织很好地代偿，因而血浆Nampt水平不改变。在这点上，脂肪特异性Nampt基因敲除对血液Nampt水平的影响更大。Yoon等[18]发现雌性脂肪特异性Nampt基因敲除鼠的血浆Nampt水平显著低于雌性对照鼠。此外，研究结果说明肝脏特异性敲除Nampt基因表达后，性别因素并不显著影响肝脏对血液Nampt的贡献率，这与脂肪特异性Nampt基因敲除小鼠有所不同[18]。
但是肝脏特异性Nampt基因敲除是否影响外周血Nampt水平还可能与病理状态和禁食因素等有关。有研究报道与健康对照组相比，肝硬化患者的血液Nampt水平显著升高[19]，提示病理状态时肝脏对血液Nampt的贡献会发生改变。另一方面， 血液Nampt水平受禁食因素影响，所以检测结果和动物进食状态有关。有研究发现禁食会升高Nampt血液水平[18]。本研究在未禁食下检测，肝脏特异性Nampt基因敲除不改变血液Nampt水平。但在禁食状态下，各组织对血液Nampt贡献情况很可能会发生改变，从而引起血液Nampt水平变化。本研究所反映的仅是在非禁食的生理状态下以及脑缺血后的肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠的外周血Nampt水平，在其他条件下肝脏特异性Nampt基因敲除是否对血液Nampt水平有影响有待进一步研究。
本研究的一个重要目的是确认肝脏来源Nampt是否参与脑缺血损伤及修复。在缺血性脑卒中时，机体除了调动脑内细胞的Nampt发挥保护作用，肝脏来源的Nampt是否也参与了机体的内在防御修复作用仍属未知。本研究采用电凝法制备脑卒中模型和肝脏特异性Nampt基因敲除动物开展研究。电凝法手术在直视下操作，手术中出血量少，造模成功率高，导致的脑缺血效果稳定，可模拟永久性脑梗死。造模后小鼠出现轻度到中度神经功能损伤，脑片TTC染色出现白色梗死区域，说明电凝法可成功制备MCAO模型。肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠肝脏Nampt蛋白表达下降，而脑内Nampt蛋白表达不受影响，非常适合本课题的研究目的。研究结果显示，同一性别，与野生型相比，肝脏特异性Nampt基因敲除并不影响脑卒中的相对梗死体积和神经行为学评分，说明肝脏来源Nampt不主要参与脑缺血损伤及修复。这一结果的原因可能与肝脏来源Nampt对血液Nampt的贡献率不大有关。血液Nampt的水平是外周Nampt发挥脑生物学功能的基础。在正常条件下，本研究已证实肝脏来源Nampt对血液Nampt的贡献率不大。在脑卒中条件下，卒中后24 h肝脏特异性Nampt基因敲除组和对照组小鼠血液Nampt水平无显著性差异，也说明肝脏来源Nampt对卒中后血液Nampt变化的贡献率不大。
本研究显示，肝脏特异性Nampt基因敲除后，雄性小鼠比雌性小鼠血浆中Nampt表达水平略高，但是后续这两种性别小鼠在缺血后脑梗死面积并没有显著性差异。在生理状态下，LNKO雄性比LNKO雌性血液Nampt水平表达略高。脑卒中24 h后，LNKO雄性小鼠比LNKO雌性小鼠血液Nampt水平有升高趋势，但无统计学差异。这两个血液水平的结果是比较一致的。同样，从脑梗死结果来看，虽然LNKO雌性小鼠的脑梗死体积和LNKO雄性小鼠相比无统计学差异，但是有升高趋势。从行为学评分来看，LNKO雌性小鼠的神经功能学损伤评分相比LNKO雄性小鼠也有升高趋势。这两个结果与血液水平也是总体一致的。
血液水平Nampt改变仅仅是影响脑梗死严重程度的一个因素，组织水平Nampt改变也会影响脑梗死程度。不仅如此，动物的个体差异，手术操作的差异，也会影响脑梗死程度。因此，在现有的动物例数下，两种性别的小鼠在缺血后脑梗死面积并没有统计学差异。后续可以考虑进一步扩大例数，确认两种性别小鼠在脑梗死程度上是否存在差别，并同时观察脑组织Nampt水平是否在两种性别小鼠脑缺血模型上有差别，以明确不同性别小鼠外周来源Nampt和脑组织Nampt对卒中的影响是否存在差异。
Nampt是防治脑卒中的内源性靶点[3]，是兼具有多种重要功能的脂肪因子。已知Nampt 可被分泌入血，血液Nampt具有酶活性，有生物学功能[12]。外周来源Nampt很可能是机体维持生理稳态，在病理状态下加强防御、促进修复的重要内源性调控因子。因此，确认Nampt的血液来源和探究血液Nampt的潜在生物学功能具有重要意义。本研究首次确认了肝脏来源Nampt对生理状态血液Nampt的贡献情况和对脑缺血损伤的作用，为后续研究打下了重要基础。当然，本研究也存在不足，比如仅观测卒中后24 h的情况，未观察多个时间点的卒中情况，以及卒中慢性恢复期的情况。血液Nampt的另一个主要来源是脂肪，脂肪来源Nampt对血液Nampt的贡献情况已有报道[18]，但对脑缺血损伤的作用尚未见报道。这些都有待进一步研究探索。
Effects of liver-specific Nampt knockout on ischemic stroke
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摘要:
目的 烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，Nampt)是缺血性脑卒中的治疗新靶点。本研究旨在阐明肝脏来源的Nampt是否对缺血性脑卒中具有保护作用。 方法 运用Cre/loxP系统制备肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠。将NamptloxP/loxP小鼠与肝脏特异性表达Cre重组酶小鼠(Alb-Cre)进行杂交，采用聚合酶链反应方法鉴定子代基因型。测定基因敲除小鼠和同窝对照小鼠的体重。蛋白免疫印迹法检测小鼠肝脏和脑中Nampt蛋白的表达。采用电凝法对肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠和对照小鼠制备大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)脑卒中模型，造模24 h后对各组小鼠进行神经功能损伤评分，TTC染色测定脑梗死体积，ELISA法检测各组小鼠血浆Nampt水平。 结果 成功构建肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠，其基因型为NamptloxP/loxP Alb-Cre。肝脏特异性Nampt基因敲除组肝脏Nampt蛋白表达与对照组相比下降74.2%。脑Nampt蛋白的表达在敲除组与对照组之间无显著性差异。肝脏特异性Nampt基因敲除对小鼠的体重无影响。正常生理条件下，同性别肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠与对照小鼠血浆Nampt水平无明显差异。MCAO造模24 h后，肝脏特异性Nampt基因敲除组与对照组神经行为学损伤评分、脑梗死体积和血浆Nampt浓度也无显著性差异。 结论 成功构建肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠；肝脏来源Nampt对缺血性脑卒中没有明显保护作用。 -
关键词:
- 烟酰胺磷酸核糖转移酶 /
- 特异性敲除 /
- 肝脏 /
- 脑卒中
Abstract:Objective Nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt) is a new therapeutic target for ischemic stroke. The aim of this study was to investigate protective effect of liver-derived Nampt on ischemic stroke. Methods Liver-specific Nampt knockout mice were generated using the Cre/loxP system. NamptloxP/loxP mice were crossed with liver-specific Cre recombinase expression mice (Alb-Cre), and the progeny genotypes were identified by polymerase chain reaction. Body weight of knockout mice and control mice were measured. Nampt in liver and brain was determined by Western blot assay. Middle cerebral artery occlusion (MCAO), a classical ischemic stroke model, was generated in liver-specific Nampt knockout mice and control mice by electrocoagulation. After 24 h of modeling, neurological deficit scores of each group were evaluated and TTC staining was performed to determine the cerebral infarction volume. The level of plasma Nampt in each group was determined by ELISA. Results Liver-specific Nampt knockout mice with the genotype of NamptloxP/loxPAlb-Cre were successfully constructed. The hepatic Nampt expression in knockout mice was significantly decreased by 74.2% compared to control mice, while there was no significant difference in the expression of brain Nampt protein between the knockout group and the control group. Specific knockout of liver Nampt gene expression had no effect on the body weight of mice. Under normal physiological conditions, there was no significant difference in plasma Nampt levels between liver-specific Nampt knockout mice and control mice of the same gender. 24 h after MCAO modeling, there were no significant differences in neurological deficit scores, cerebral infarct volume and plasma Nampt concentration between liver-specific Nampt knockout group and control group. Conclusion Liver-specific Nampt knockout mice are successfully constructed. Liver-derived Nampt has no significant protective effects on ischemic stroke. -
Key words:
- Nampt /
- specific knockout /
- liver /
- stroke
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骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症[7]。
冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。
1. 材料
1.1 动物
SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。
1.2 试剂
α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。
1.3 仪器
371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。
2. 方法
2.1 CSE制备
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文[12]。
2.2 BMMs分离与培养
选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×106个[13]。
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
在96孔板中，BMMs以8×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。
2.4 体外破骨细胞分化实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。
将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色[14]。
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。
骨吸收实验：BMMs以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×103个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积[15]。
2.6 q-PCR检测
在12孔板中，BMMs以5×104个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文[16]。
2.7 蛋白印迹法检测
在6孔板中，BMMs以5×105个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。
2.8 动物造模、分组及给药
在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）[14]。术后1周，按照文献报道方法[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。
2.9 HE染色和TRAP染色
小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。
2.10 ELISA法检测血清生化指标
小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。
2.11 统计学方法
使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。
图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数**P<0.01，与RANKL组比较在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。
图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比**P<0.01，与RANKL组比较骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。
图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1*P<0.05，**P<0.01，与RANKL组比较3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。
图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。
图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）A.TRAP；B.ALP；C.BGP；*P＜0.05，**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较4. 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。
研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。
F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。
我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。
总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。
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图 4 12 周龄肝脏特异性 Nampt 基因敲除小鼠体重情况(n≥7)
WT: 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠同窝对照；LNKO: 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠。***P<0.001, 与WT(雄) 组比较；###P<0.001，与LNKO (雄)组比较。
图 5 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠肝脏、脑组织中Nampt蛋白的表达(n=3)
A.各组小鼠肝脏Nampt蛋白免疫印迹代表图和相对灰度统计；B.各组小鼠脑Nampt蛋白免疫印迹代表图和相对灰度统计，相对表达量为Nampt与GAPDH灰度值之比；WT: 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠同窝对照；LNKO: 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠。**P<0.01，与WT(雄) 组比较；##P<0.01，与WT(雌)组比较。
图 6 生理条件下肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠血浆Nampt蛋白表达(n≥6)
A.不同log[CNampt(ng/ml)]与450 nm处吸光度值按照四参数Logistic曲线拟合得到的标准曲线；B. 生理条件下各组小鼠血浆Nampt蛋白水平；WT: 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠同窝对照；LNKO: 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠。*P<0.05，与LNKO (雄)组比较。
图 7 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠MCAO造模24 h后脑梗死情况(n≥8)
A.各组MCAO造模24 h后TTC染色典型脑片；B.MCAO造模24 h后各组小鼠相对脑梗死体积计算。WT: 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠同窝对照；LNKO: 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠。
图 8 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠MCAO造模24 h后血浆Nampt蛋白表达(n≥6)
WT: 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠同窝对照；LNKO: 肝脏特异性Namp基因敲除小鼠。
表 1 基因型鉴定引物
序号 引物序列(5’-3’) 鉴定基因型 条带位置 引物1 野生型上游引物:
TGCAAACATCACATGCACAC
通用型下游引物:
TTGGCCCCTTACCATAACTG
突变型上游引物:
GAAGCAGAAGCTTAGGAAGATGGNamptloxP/loxPAlb-Cre 150 bp
351 bp
390 bpNamptloxP/loxP 351 bp 引物2 下游引物:
TTCCAGGCTATTCTGTTCCAG
上游引物:
TCTGGCTCTGTGTACTGCTGANamptloxP/loxP 300 bp 
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表 2 各组小鼠MCAO造模24 h后神经行为学损伤评分 (n≥8)
组别 神经行为学损伤评分(分) WT雄性组 1.20±0.42 LNKO雄性组 1.50±0.71 WT雌性组 1.32±0.56 LNKO雌性组 1.63±0.69 WT组 1.26±0.49 LNKO组 1.56±0.68 WT: 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠同窝对照；LNKO: 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠。
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