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亚洲国家儿童和青少年近视罹患率逐年攀升，严重影响到身心健康，并且随着近视程度的加深，还可能出现不可逆的眼底改变，严重时可致盲[1-2]。阿托品是治疗近视的首选药物，广泛运用于临床。1%阿托品临床疗效确切，能有效预防和治疗近视，然而畏光、刺激、干眼等副反应发生率较高，多数患者长期使用时难以耐受[3-7]。多项临床研究对不同浓度阿托品的治疗作用及副作用深入观察，发现0.01%阿托品治疗近视时副作用明显低于1%阿托品，且停药后的反弹现象发生率也显著降低，但在近视快速进展期的控制效果却不及1%阿托品[8-11]。
因此，积极探索合理的治疗方案，在降低阿托品用量的同时保证其治疗效果成为近视治疗的关键和难点。本研究采用豚鼠近视模型观察比较优化方案（交替使用1%、0.01%阿托品）与单一浓度方案在近视控制效果上的差异。
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选择21 d已断乳的英国三色豚鼠（丹阳市吕城镇奥臣实验养殖场），经眼健康和屈光度筛选（屈光度为2.0～7.0 D，双眼屈光参差<2.0 D，双眼瞳孔直径差值<0.1 mm）后入组。
46只豚鼠随机选取6只作为空白对照组，其余40只随机分为5个干预组：1%阿托品组、0.01%阿托品组、优化组1（1～2周使用1%阿托品，3～4周使用0.01%阿托品）、优化组2（1～2周0.01%阿托品，3～4周用1%阿托品）、生理盐水组。
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46只豚鼠均以透明亚克力板鼠笼饲养于清洁级动物房内，采用12 h-12 h昼夜循环节律，光照度保持在400～500 lux。采用头套法[12]对干预组豚鼠随机选择单眼进行形觉剥夺近视造模，并定义为模型眼，对侧暴露眼为自身对照眼，所有干预组豚鼠佩戴头套4周，每日上午8:00至10:00按分组对模型眼进行滴眼给药（优化组1前2周使用1%阿托品，后2周使用0.01%阿托品滴眼；优化组2前2周使用0.01%阿托品，后2周使用1%阿托品滴眼）；空白对照组豚鼠不采取任何处理。
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在暗室中用红外偏心摄影验光仪（昆山德梅内克机器人科技有限公司）测量小鼠眼球的屈光度。测量前将豚鼠置于暗室中至少5 min以适应光线，随后将其放在距摄像头前1 m的可移动架子上，调整豚鼠位置，当被测眼的浦肯野像出现在瞳孔中央时，记录测量屈光度值。每只眼测量5次，取平均值用于分析。
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使用实验动物A超（Strong 6000A, 武汉思创眼科）测量眼轴数值。测量前先对豚鼠进行眼球表面麻醉，后将探头垂直轻贴眼球表面，待波形图呈现完整峰型时机器自动记录数值。每眼测量8次，取均值用于分析。
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豚鼠全身麻醉后立即用Micron OCT成像系统（Phoenix）测量豚鼠脉络膜厚度。麻醉前每5 min用复方托吡卡胺滴眼液散瞳，共3次。用缝合线将豚鼠上结膜吊起，角膜表明涂抹氧氟沙星眼膏作为耦合剂和抗菌剂，将光学探头按照视轴方向抵近接触角膜中央区，屏幕上可见实时二维光学切片图，取距离视盘中心1 807 μm处测量脉络膜厚度6次，取均值。
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将麻醉后的豚鼠固定于操作台，打开胸腔，暴露心尖，用静脉输液针插入左心房并注入预冷的组织固定液，待心脏膨起后立即剪断右心耳，并继续缓慢推入组织固定液，待循环血全部置换后迅速解剖双侧眼球，放入眼球固定液，并做好标记。对标本进行脱水、包埋、切片处理后采用苏木素-伊红染色进行巩膜组织结构及厚度的观察。
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本实验所有计量资料以（
$\bar x \pm {\rm{s}}$ ）表示。采用软件SPSS 25.0进行数据的统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。 -
空白对照组（图1A、2A）实验前后双眼屈光度和眼轴差异均无统计学意义（P>0.05）。生理盐水组（图1 B）屈光度和眼轴长度在1周末时为（0.88±1.21）D和（7.56±0.10）mm，与实验前（3.68±1.12）D和（7.38±0.09）mm相比有显著性差异（P<0.01），2周末时该组出现绝对近视（−0.33±1.41）D和（7.62±0.08 mm），4周末时屈光度和眼轴持续呈近视化改变（−1±2.47）D和（7.74±0.09）mm。给药各组模型眼屈光度、眼轴长度均有不同程度近视化改变。各干预组对照眼的屈光度、眼轴长度于实验前后均无显著差异（P>0.05）。以上结果说明豚鼠近视模型建立取得成功。
图 1 各组屈光度随时间变化值
图 2 眼轴长度随时间变化
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空白对照组（图1A）双眼屈光度于实验前后均无统计学差异（P>0.05）；生理盐水组（图1B）模型眼屈光度迅速下降，每周测量数值均与实验前有显著差异（P<0.01）；1%阿托品组（图1C）模型眼屈光度呈下降趋势，于第3、第4周末时分别降至（1.75±0.69）D和（1.38±1.15）D，均与实验前（3.50±1.14）D有显著差异（P<0.05）；0.01%阿托品组（图1D）模型眼屈光度快速下降，在第1周末时与实验前相比即存在显著性差异[（1.32±1.15）D 对（2.82±1.35）D, P<0.01]，4周末时出现绝对近视（−0.64±0.20）D；优化组1（图1E）模型眼屈光度缓慢下降，第4周末时的屈光度值为（0.95±1.90）D，与实验前[（3.55±1.85）D]相比有统计学差异（P<0.01），该组抑制屈光度下降结果低于1%阿托品组，但高于0.01%阿托品组。优化组2（图1F）模型眼实验前2周快速下降，第2周末时的屈光度（0.79±0.93）D与实验前（2.93±1.42）D相比有显著性差异（P<0.01）；该组第3周换用1%阿托品后，屈光度回升至（2.10±1.00）D，与第2周末的屈光度值有显著性差异（P<0.01）；第4周末时屈光度值下降至（1.36±1.61）D，与实验前无统计学差异（P>0.05）。各组对照眼实验前后屈光度无统计学差异（P>0.05）。
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空白对照组（图2A）双眼眼轴长度于实验前后均无统计学差异（P>0.05）；生理盐水组（图2B）模型眼眼轴迅速延长，每周测量数值均与实验前有显著差异（P<0.01）；1%阿托品组（图2C）模型眼眼轴长度于实验前后均无统计学差异（P>0.05）；0.01%阿托品组（图2D）模型眼于实验1周时出现了明显的眼轴延长（7.47±0.08）mm对（7.37±0.06）mm，于第4周末时该组眼轴延长至（7.62±0.08）mm，均与实验前有显著差异（P<0.05）；优化组1（图2E）模型眼造模前眼轴长度为（7.39±0.05）mm，于第2周末时眼轴长度明显延长（7.52±0.05）mm，P<0.05，第3、4周使用0.01%阿托品治疗后，2周内眼轴延长速度有所减缓[（7.54±0.04）mm和（7.59±0.03）mm]；优化组2（图2F）模型眼眼轴在实验前2周迅速延长，造模前眼轴长度为（7.37±0.07）mm，实验1周时出现了明显的眼轴延长[（7.50±0.07）mm, P<0.01]，第3、4周使用1%阿托品治疗后眼轴长度为（7.54±0.06）mm和（7.56±0.05）mm，与第2周末相比差异无统计学意义（P>0.05）。各组对照眼实验前后眼轴长度无统计学差异（P>0.05）。
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OCTA结果提示，空白对照组脉络膜结构完整，边界清晰。干预组模型眼脉络膜均出现不同程度的结构和形态的改变，如组织厚度下降，边界模糊等（图3）。OCTA结果可见各干预组脉络膜厚度差别较为明显，大小依次为：1%阿托品组>优化组2>优化组1> 0.01%阿托品组>生理盐水组（表1）。
图 3 各组模型眼脉络膜
表 1 各组模型眼脉络膜厚度
组别 脉络膜厚度（l/μm） 空白对照组 72.25±3.30**## 生理盐水组 33.60±2.19 1%阿托品组 57.00±1.73 0.01%阿托品组 41.00±4.08**## 优化组1 48.67±0.58**## 优化组2 51.33±2.52**# * P<0.05、** P<0.01，与空白对照组比较; # P<0.05、## P<0.01，与1%阿托品组比较 -
HE染色结果提示，空白对照组巩膜组织胶原纤维排列整齐、分布均匀、连接致密。各干预组模型眼的巩膜存在不同程度的组织结构改变，如组织厚度变薄、胶原纤维粗细不均、排列稍紊乱、组织间隙变大等（图4）。HE染色可见各组巩膜厚度的差别较明显，空白对照组巩膜厚度为（91.03±1.68）μm，各干预组豚鼠模型眼的巩膜厚度均小于空白对照组，厚度大小依次为：1%阿托品组>优化组2 >优化组1> 0.01%阿托品组>生理盐水组（表2）。
图 4 各组模型眼巩膜HE染色（HE × 20）
表 2 各组模型眼巩膜厚度
组别 巩膜厚度（l/μm） 空白对照组 91.03±1.68**## 生理盐水组 39.17±2.15 1%阿托品组 74.4±1.95** 0.01%阿托品组 54±2.99**## 优化组1 63.43±2.10**## 优化组2 67.40±2.79**# * P<0.05，** P<0.01，与空白对照组比较; # P<0.05，## P<0.01，与1%阿托品组比较。 -
阿托品是非选择性M受体拮抗剂，从19世纪就开始用于近视治疗，目前仍在临床广泛使用。大量研究证实阿托品是目前控制近视进展最有效的药物[13-14]，也是临床上治疗近视使用度最高的药物，但是在临床应用过程中1%阿托品的副作用一直备受争议。国内外已有大量研究报道0.01%阿托品在长期控制近视中有较好效果，并且其副作用及停药反弹现象较轻，但是短期内对于迅速发展的近视控制效果欠佳[6, 11]。本研究结合不同浓度阿托品的作用优势和临床实际提出优化方案1，动物实验证明优化方案1同样能有效控制屈光度的快速发展，但是该方案对于抑制眼轴增长作用和对脉络膜、巩膜形态保护作用不如1%阿托品组，可能因为0.01%浓度过低，对组织、形态上作用力不足。此外，有研究表明，给予明亮光照和阿托品可协同刺激眼内多巴胺的生成，有助于延缓近视发展[15]，但是1%浓度的阿托品因畏光发生率为62.12%（205/330，中国香港）[16]，对于联合光照治疗有较大局限，而0.01%阿托品的畏光发生率为2.1%（2/110，中国云南）[17]，1%阿托品有效控制近视发展后，采取0.01%阿托品结合沐浴阳光疗法维持防治效果也为近视治疗提供一种可能。近期有学者针对0.01%～0.1%浓度进行临床随机对照研究，发现较低浓度的阿托品滴眼液如0.05%、0.025%表现出更好的防控效果，在2年内最有效地控制了屈光度进展和眼轴延长，且对视力相关生活质量均无不良影响 [17-19]，提示在0.01%和0.1%浓度阿托品之间还存在更优治疗浓度，因此本研究的优化方案1中维持治疗浓度还需进一步探究。
脉络膜和巩膜在形觉剥夺性近视和离焦性近视中对于眼焦调整以及眼球生长调节中发挥重要作用。动物研究发现，近视眼中均存在不可逆脉络膜、巩膜变薄的情况，临床同样证明，脉络膜、巩膜厚度与近视的严重程度高度相关[19-20]。近年来，国外临床上常使用0.01%阿托品治疗早期近视，或对远视储备不足的患者进行预防治疗[20]。但是其在短时间内对于快速发展的近视控制效果欠佳，对于脉络膜和巩膜的保护作用效果不如1%阿托品[21]。优化方案2发现，该组给药方案对于脉络膜和巩膜纤维层结构和形态的维持作用接近1%阿托品组，并且明显优于0.01%阿托品组。值得注意的是，当0.01%阿托品换为1%阿托品后，近视发展方向被翻转，明显向远视方向移动，4周末时该组对屈光度控制效果优于1%阿托品组，并且眼轴增长速度较0.01%阿托品组明显缓慢。该结果提示，在近视早期治疗时使用0.01%阿托品，当近视控制效果不佳时换用高浓度阿托品（如1%）对于近视治疗时机并未产生影响，也未加重脉络膜和巩膜结构的不可逆改变。这一结果与Wu等[22]在临床实验中得到的结论一致，即从低浓度阿托品（如0.01%）开始治疗，当控制效果不够有效（≥0.5 D/6个月，亚洲）时，可以考虑增加阿托品浓度代替治疗。
本研究也存在一定局限性。与临床研究周期相比，本研究观察时间尚短，不能提供长期使用的控制效果数据。并且，在实验期间报告了几种给药方案的治疗效果，但未进行停药后效果的监测，该部分在下一步的研究中会开展相应的实验设计。此外，优化组2换用1%阿托品后，模型眼屈光度出现翻转的现象。本研究尚未对此深入探究，目前无法判断具体影响因素，对于翻转作用的机制未来需要作进一步研究。
Study on the effect of optimized dosing regimen of atropine on the treatment of myopia in guinea pigs
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摘要:
目的 研究优化的阿托品给药方案对豚鼠近视的治疗作用。 方法 从46只21 d龄豚鼠中随机选取6只作为空白对照，其余40只随机分为5个干预组：1%阿托品组、0.01%阿托品组、优化组1、优化组2及生理盐水组。随机选择干预组豚鼠单眼作为模型眼并予形觉剥夺，对侧眼为自身对照，干预时间均为4周。于实验前及每周末测量豚鼠双眼屈光度、眼轴数据，实验结束后行脉络膜和巩膜测量。 结果 0.01%阿托品组模型眼屈光度迅速下降，实验前后有显著差异[（2.82±1.35）D对（−0.64± 0.20）D, P<0.01]。1%阿托品组、优化组1模型眼屈光度下降，实验前后均有统计学差异[（3.50±1.14）D 对（1.38±1.15）D, P<0.05;（3.55±1.85）D 对（0.95±1.90）D, P<0.01]。优化组2模型眼屈光度下降，实验前后无统计学差异[（1.36±1.61）D 对（2.93±1.42）D, P>0.05）]。形觉剥夺后，1%阿托品组眼轴长度无显著变化（P>0.05），其余各干预组眼轴均有不同程度延长。1%阿托品组、优化组2、优化组1脉络膜和巩膜的厚度大于 0.01%阿托品组。 结论 两种优化给药方案的抑制形觉剥夺豚鼠近视作用优于0.01%阿托品，与1%阿托品效果相近。 Abstract:Objective To study the effect of optimized atropine administration regimen on myopia in guinea pigs. Methods Forty six 21-day old guinea pigs were used for this study. Six were randomly selected as blank control, and the remaining 40 were randomly divided into 5 intervention groups: 1% atropine group, 0.01% atropine group, optimized group 1, optimized group 2, and saline group. One eye of the guinea pig in the intervention groups was randomly selected as the model eye and given form deprivation, and the contralateral eye was the self-control. The duration of intervention was 4 weeks. The diopter and axial length of guinea pig eyes were measured before the experiment and at each weekend. Choroid and sclera were measured after the experiment. Results The diopter of the model eyes in the 0.01% atropine group decreased rapidly. There was a significant difference before and after the experiment [(2.82±1.35)D vs (−0.64±0.20)D, P<0.01]. The diopter of model eyes decreased in 1% atropine group and optimized group 1, and the difference was statistically significant [(3. 50±1.14)D vs (1.38±1.15)D, P<0.05; (3.55±1.85)D vs (0.95±1.90)D, P<0.01]. In optimized group 2, the diopter of model eyes decreased, and there was no significant difference before and after the experiment [(1.36±1.61)D vs (2.93±1.42)D, P>0.05). After form deprivation, the axial length in 1% atropine group did not change significantly (P>0.05). The axial length in other intervention groups was extended to varying degrees. The thickness of choroid and sclera in 1% atropine group, optimized group 1 and optimized group 2 were greater than that in 0.01% atropine group. Conclusion The two optimized dosing regimens worked better than 0.01% atropine in inhibiting myopia in guinea pigs with form deprivation, and were similar to 1% atropine. -
Key words:
- myopia /
- atropine /
- form deprivation /
- guinea pigs
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溃疡性结肠炎（ulceractive colitis, UC）属于炎症性肠病的一种，有着较高的发病率，其特征为损伤性炎症，近年来有关其病因及发病机制的研究受到广泛关注，但至今仍不明确[1]。对于溃疡性结肠炎的治疗目前多采用手术、抗感染、糖皮质激素及免疫抑制剂等治疗，但上述治疗手段均为对症治疗，且药物长期使用的不良反应很容易造成疾病复发[2]。因此，探究溃疡性结肠炎的发病机制，将为今后治疗药物的研发提供理论基础。
Metrnl（Meteorin-like）是近年来新发现的神经营养因子，也叫Cometin, Subfatin或是IL-39[3-4]。 Jorgensen等[4]在2012年将Metrnl描述为类似于Meteorin（Metrn）的神经营养因子。Metrnl基因开放阅读框包含4个外显子，由936个碱基对编码311个氨基酸。Metrnl蛋白包含45个N端信号肽序列，切除信号肽后的266个氨基酸构成分子量约为30 000的成熟蛋白分子，整个蛋白分子没有穿膜区域，是一种分泌蛋白。到目前为止，关于Metrnl功能的研究较少，我们前期针对该蛋白相关研究确认Metrnl为一种新的细胞因子，阐明了Metrnl通过PPARγ信号通路介导胰岛素的增敏作用的重要机制[5]。 Jorgensen等[4]报道了Metrnl在神经突触生长和成神经细胞迁移中的神经营养活性。Watanabe等[6]报道，Metrnl是潜伏过程（Latent process，LP）基因，可用于细胞分化和神经突触延伸。脂肪组织Metrnl能促进脂肪细胞分化、改善代谢、抑制炎症从而调节脂肪功能，对抗肥胖引起的胰岛素抵抗[7]。通过检测Metrnl在各种组织中的表达，我们发现Metrnl在人和小鼠胃肠组织中，特别是在肠上皮细胞中都高度表达，并发现肠上皮Metrnl敲除后可以通过抑制肠上皮细胞的自噬而加重溃疡性结肠炎，提示 Metrnl是溃疡性结肠炎的治疗靶点[8]。
肠道微环境形成了良好的微生物群栖息地，肠道微生物群被认为是人体的重要器官，越来越多的研究将这种微生物环境与胃肠道疾病联系起来。肠道菌群在溃疡性结肠炎中起着重要作用，如在无菌状态下，无法制备出某些小鼠结肠炎模型（如IL-10缺陷型小鼠等）[9-10]。也有研究报道，在治疗溃疡性结肠炎患者时，联合使用抗生素也显示出了较好疗效[11]。此外，与健康人群相比，溃疡性结肠炎患者的肠道菌群组成也发生了显著变化[12]。但由于人类肠道菌群的复杂性和多样性，目前尚未清楚某些特定菌属与溃疡性结肠炎发病机制的关系。
因此，本研究聚焦溃疡性结肠炎，从肠道微生态角度出发，探究肠上皮Metrnl对于溃疡性结肠炎的作用以及对肠道菌群调节机制的影响。
1. 材料与方法
1.1 动物、试剂和仪器
雄性C57小鼠（8周龄，20只，16~20 g），上海西普尔-必凯实验动物有限公司（生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016）。Villin-cre小鼠[B6.Cg-Tg(Vil1in-cre)1000Gum/J，021504]，2只，16~20 g，美国JAX公司（北京澄天生物科技有限公司代理），生产许可证号：SYXK（京）2018-0016），用于产生肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除小鼠（Metrnl(-/-)）。所有小鼠饲养于相对洁净环境下，使用独立通风系统（individual ventilated cages, IVC）动物房，温度恒定（22~26 ℃），室内明暗交替12 h（08:00至20:00照明），相对湿度为40%~70%，笼内维持正压20~25 Pa，每小时换气60~70次。所有实验动物的使用，都经过海军军医大学动物管理机构的同意和认证，符合实验动物饲养及相关管理规定。所有动物实验均按照美国国家卫生研究院实验动物的护理和使用指南进行，并得到海军军医大学动物伦理委员会的批准。IVC系统购自上海鸣励实验室科技发展有限公司。TRIzol试剂（15596026），美国Invitrogen公司；葡聚糖硫酸钠盐（dextran sodium sulfate，DSS），MFCD00081551，分子量36 000~50 000，美国MP公司，引物，生工生物工程有限公司；包埋机（JB- L5，德国徕卡有限公司）；切片机（RM2126，德国徕卡有限公司）；RT-PCR仪器（ABI 7500系统，美国赛默飞公司）；粪便DNA提取试剂盒（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit，Qiagen, Hilden, 德国）；紫外微量分光光度计（NanoDrop 2000，Thermo Scientific, 美国）；DNA凝胶回收试剂盒（AxyPrep DNA GelExtraction Kit，Axygen Biosciences, 美国）；微型荧光计（QuantiFluor-ST，Promega, 美国）；测序仪（Illumina MiSeq，Illumina, 美国）。
1.2 肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除小鼠的制备
首先按照本课题组已报道的方法[5]制备Metrnlloxp/loxp小鼠。根据报道的Metrnl(-/-)小鼠的繁殖策略[13]，即将Metrnlloxp/loxp小鼠与购买的Villin-Cre小鼠进行交配，产下后代小鼠基因型为Metrnlloxp/wtVillin-Cre。将Metrnlloxp/wtVillin-Cre小鼠和Metrnlloxp/loxp小鼠交配，产生下一代Metrnlloxp/loxpVillin-Cre小鼠。继续与Metrnlloxp/loxp交配，产下的后代，经基因型鉴定分别为Metrnlloxp/loxpVillin-Cre（Metrnl(-/-)）和Metrnlloxp/loxp（Metrnl(+/+)）。
1.3 RT-PCR定量肠道组织Metrnl mRNA表达
按照本课题组已报道的方法[3]，使用TRIzol试剂从肠道组织中提取总RNA，并使用ABI 7500系统进行RT-PCR。最终的20 μl反应混合物包括10 μl SYBR Green，2 μl cDNA模板和1 μl引物。通过重复反应确定平均阈值循环（Ct），将靶基因表达标准化为GAPDH，并使用ΔΔCT方法获得定量测量结果。Metrnl上游引物（F）CTGGAGCAGGGAGGCTTATTT，下游引物（R）GGACAACAAAGTCACTGGTACAG；GAPDH上游引物（F）GTATGACTCCACTCACGGCAAA，下游引物（R）GGTCTCGCTCCTGGAAGATG。
1.4 DSS诱导肠炎模型制备
雄性C57小鼠（8周龄）于实验室适应2周后，按照本课题组已报道的方法进行模型制备[7]，将DSS溶于水中，分别至终浓度为3%和1%，让小鼠自由饮用。
小鼠溃疡性结肠炎疾病程度评分，按照我们之前已报道的的评分标准进行评分[8]，对体重下降程度、大便性状、血便情况共3部分分别进行评分，然后进行加和，计算总分数。具体评分标准如下（表1）。
表 1 小鼠溃疡性结肠炎疾病程度评分表疾病评分 体重下降 (%) 大便性状 大便潜血 0 <1 正常 阴性 1 ≥1-5 - + 2 ≥5-10 软 ++ 3 ≥10-15 - +++ 4 ≥15 腹泻 ++++ 注：“-” 无此性状；“+” 潜血程度。 1.5 结肠长度检测及HE染色
小鼠处死后，取整个结肠部位，测量长度进行比较。然后将结肠下段部位组织用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片机切至4 μm的切片，按照之前的实验方法[14]，进行HE染色，染色后在光学显微镜下观察炎症细胞浸润情况，组织损伤情况并拍照记录。
1.6 肠道菌群测定
使用16S核糖体RNA基因测序技术检测肠道菌群。为了进行样品收集和DNA提取，从实验小鼠中收集粪便样品，并在取样后3h内将其冷冻在−80°C下。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit进行DNA提取。使用NanoDrop 2000测量细菌DNA的浓度。然后，将16S核糖体RNA基因测序用于检测细菌DNA。基因的V3-V4区域使用FastPfu聚合酶通过条形码索引引物（338F和806R）进行PCR扩增。然后通过AxyPrep DNA GelExtraction Kit，凝胶提取纯化扩增子，并使用QuantiFluor-ST进行定量。将纯化的扩增子以等摩尔浓度合并，并使用Illumina MiSeq仪器进行末端配对测序。
1.7 微生物宏基因组学分析
16S rRNA测序数据由Quantitative Insights Into Microbial Ecology平台（V.1.9.1）处理，并进行了MegaBLAST搜索，将生物分类单位的读数（OTU）与国家生物技术信息中心16S rRNA数据库中的参考序列比对。按照文献报道的方法[15]进行宏基因组学分析，从16S rRNA序列推算肠道微生物组的基因组，并且对每个样品的基因含量进行了预测。
1.8 统计分析
本实验结果数据以（
$\bar x $ ±s）表示，使用SPSS18.0软件进行统计分析。多组以上比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），各组与正常对照组比较采用Dunnett t检验法，两组比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 Metrnl(-/-)小鼠未表现结肠炎症状
我们构建了肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除（Metrnl(-/-)）小鼠，并检测了Metrnl mRNA在大肠和小肠组织中的表达。结果表明，Metrnl(-/-)小鼠中Metrnl mRNA的表达在结肠和小肠组织中极低（图1A）。 HE结肠切片显示Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠之间均无组织损伤和炎症细胞浸润（图1B）。以上结果表明，肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除后不会诱发溃疡性结肠炎。
2.2 溃疡性结肠炎模型制备条件的选择
在建立DSS诱发的溃疡性结肠炎模型之前，为了选择最佳的观察时间和DSS给药浓度，我们分别选择3％DSS和1％DSS进行造模，并观察了不同DSS浓度下C57小鼠的存活时间。结果显示，在3％DSS组的第6天，出现了小鼠死亡；直至给药10 d，全部小鼠死亡（图2A）。在1％DSS组中，未观察到小鼠死亡。与对照组相比，3％DSS组的小鼠体重在第5天时显著性降低（P<0.05），而1％DSS组的体重并无显著改变（图2B）。同样，与对照组相比，3％DSS组小鼠DAI增加（P<0.05），结肠长度显著性缩短（P<0.05），而1％DSS组在疾病活动指数、结肠长度方面均无明显变化（图2C-D）。 组织形态学方面，3％DSS组表现出结肠炎表型，具有明显的组织损伤，而对照组并无明显变化（图2E）。因此，我们选择3％DSS和5 d的给药时间作为后续实验条件。
2.3 Metrnl缺乏对DSS诱导的溃疡性结肠炎的影响
给予Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠3％DSS后，两组小鼠均表现出溃疡性结肠炎症状，其特征为持续的体重减轻、疾病活动指数增加、血性腹泻、结肠长度缩短以及结肠炎症（图3）。在此过程中，在给药后第5天时，与Metrnl(+/+)小鼠体重减轻（−8.27± 1.32）%相比，Metrnl(-/-)小鼠的体重减轻（−14.92±1.05）%，具有统计学差异（P<0.05，图3A）；与Metrnl(+/+)小鼠的疾病活动指数（6.00±1.63）相比，Metrnl(-/-)小鼠显著增加至（9.67±1.38）（P<0.05，图3B）；与Metrnl(+/+)小鼠结肠长度（7.08±0.89 cm）相比，Metrnl(-/-)小鼠结肠更短（5.77±0.58 cm）（P<0.05）（图3D）；为了排除上述差异不是由小鼠摄入不同量的3%DSS引起的，我们还检测了两组小鼠的饮水量。结果显示两组小鼠饮水量之间并无显着差异（图3C）。
图 3 Metrnl敲除后对DSS诱导的溃疡性结肠炎的影响A. 体重；B.疾病评分；C.水摄入量；D.结肠长度；E.结肠组织HE染色P<0.05，与DSS-Metrnl(+/+)组比较。2.4 Metrnl缺乏对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的菌群平衡的影响
我们通过高通量16S rRNA基因测序，检测了Metrnl对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中肠道菌群的影响。应用Chao1 丰度估计量（chao1 richness estimator），香农多样性指数（shannon diversity index），辛普森多样性指数（simpson diversity index）三种指标评价各组小鼠中菌群的Alpha多样性（图4A-C）。结果显示，在未进行DSS造模之前，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠的Alpha多样性并无显著差异；而进行3%DSS造模后，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠出现了差异，其中Metrnl(-/-)小鼠多样性显著下降（图4A-C）。主成分分析显示，在给予3%DSS造模后的Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠之间微生物的组成显著不同（图4D）。检测小鼠粪便微生物组成，结果显示，在“门”这一层面，给予3%DSS后拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形杆菌门（Proteobacteria）在Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间存在显著的不同（图4E）。在Metrnl(-/-)小鼠中，Bacteroidetes和Proteobacteria显著降低，而Firmicutes显著升高。在“纲”这一层面，发现给予DSS后，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间拟杆菌纲（Bacteroidia）和梭菌纲（Clostridia）具有显著差异。值得注意的是，拟杆菌纲（Bacteroidia）属于拟杆菌门（Bacteroidetes）；梭菌纲（Clostridia）属于厚壁菌门（Firmicutes）（图4F）。为了进一步探究影响给予DSS后造成Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间状态的原因，我们又在“目”层面进行了检测，结果显示（图4G），拟杆菌目（Bacteroidales），属于杆菌纲（Bacteroidia）；梭菌目（Clostridiales），属于梭菌纲（Clostridia）发生了显著改变。
图 4 肠上皮Metrnl 敲除对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群动态平衡的影响A. Chao1丰度估计量；B.香农多样性指数；C.辛普森多样性指数；D.主成分分析；E.门水平上的丰度；F.纲水平上的丰度；G.目水平上的丰度P<0.05，与DSS-Metrnl(+/+)组比较。3. 讨论
本研究用DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠模型并从对肠道微生物影响的角度出发，探究肠上皮Metrnl特异性敲除对于肠道菌群调节的影响以及对溃疡性结肠炎的作用。发现Metrnl在溃疡性结肠炎小鼠模型中具有保护的功能，该效应可能是Metrnl通过对肠道菌群的调节所致。 近期有一篇关于Metrnl改善克罗恩氏病（CD）的报道，该研究表明肠系膜脂肪组织与肠道存在交互作用，发现小鼠在给予Metrnl后，可通过激活STAT5/PPARγ信号通路，从而达到促进脂肪细胞分化来减轻肠系膜脂肪组织病变的作用[16]。该研究表明Metrnl确实可以影响炎症性肠病的发生发展。除此以外，我们进一步证实了，肠上皮特异性Metrnl敲除后可以加重DSS诱导的溃疡性结肠炎，并且该作用是通过抑制AMPK-mTOR-p70S6K通路，下调了肠上皮细胞自噬水平产生的[7]。
肠道微环境形成了合适的微生物群栖息地，已证明会影响多种消化系统疾病的发生[17]。肠道菌群稳态的紊乱已被广泛认为与炎症性肠病的发病机制和进展密切相关[8]。肠道菌群主要有三种功能，分别是代谢作用，保护作用和营养作用[18-19]。正常人肠道中在“门”这一层面，主要有四类微生物群，包括拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形杆菌门（Proteobacteria）[20-21]。
溃疡性结肠炎的主要特征是有益细菌的减少。拟杆菌门（Bacteroidetes）是革兰阴性厌氧细菌，构成了哺乳动物胃肠道中主要微生物群[22]。目前认为，拟杆菌门可以通过免疫调节和维持体内平衡而对宿主发挥有益作用。据报道，拟杆菌门可以通过分泌多糖A（polysaccharide A, PSA）来增强抗炎因子IL-10的mRNA表达[23-24]。本研究结果显示出类似趋势，在给予3%DSS进行溃疡性结肠炎造模后，Metrnl(-/-)小鼠症状更加严重，与Metrnl(+/+)小鼠相比，其拟杆菌门的成分显著下降。然而，拟杆菌门在溃疡性结肠炎中并不完全有益。有报道显示，拟杆菌门可以侵入肠道组织并引起个别患者的肠道损伤[25]。因此针对该类菌属的作用还有待进一步验证。除此以外，由于SCFA具有增强肠壁屏障和免疫系统的作用，从而有助于抵抗病原体，因此产生SCFA的菌群目前认为对人体是有益的，例如Faecalibacterium prausnitzii，Roseburia或Eubacterium[26-28]。放线菌门（Actinobacteria）中的双歧杆菌属（Bifidobacterium）也是有益菌群[29-30]。然而，在该属中发现了有争议的结果，因为有研究报道显示，与对照组相比，溃疡性结肠炎患者的Bifidobacterium增加了[31- 32]，其原因可能是疾病程度的造成的。因此，需要进一步的研究来阐明该有益菌群在溃疡性结肠炎中的作用。
相反的，目前很多研究显示菌群在溃疡性结肠炎中显著增加，如变形杆菌门（Proteobacteria）下的黏附侵入性大肠杆菌属（adherent-invasive Escherichia coli）和巴斯德杆菌属（Pasteurellaceae），厚壁菌门（Firmicutes）下的韦荣氏球菌属（Veillonellaceae）和瘤胃球菌属（Ruminococcus gnavus），梭杆菌属（Fusobacterium）。我们的研究结果也显示出类似趋势，在给予DSS后，与Metrnl(+/+)小鼠相比，Metrnl(-/-)小鼠的厚壁菌的成分显著上升。除此以外，以下菌属也被认为具有潜在致病性，如大肠杆菌属（Escherichia），沙门菌属（Salmonella），耶尔森菌属（Yersinia），脱硫弧菌属（Desulfovibrio），幽门螺杆菌属（Helicobacter），弧菌属（Vibrio）[31, 33-36]。目前报道较多的是黏附侵入性大肠杆菌，此种细菌能够黏附并穿过肠道黏液屏障，侵入肠道上皮层，促进TNFα分泌和炎症的发生[37-38]。本研究表明，肠上皮特异性Metrnl敲除后，在3%DSS诱导的溃疡性结肠炎模型中，导致肠道菌群动态平衡的进一步紊乱，表明恢复菌群动态平衡对于治疗溃疡性结肠炎至关重要。
需要注意的是，大量研究表明，目前并没有明确具体的哪一种微生物群对人体是有益的，因为每个人的菌群特征都不同。一般而言，只有相对平衡的微生物群，才能最佳地维持人体的代谢和免疫功能以及预防疾病的发展。在健康的肠道中，病原菌和共生菌群可以共存而不会出现问题。但是，这种平衡的任何紊乱都会导致营养不良，从而改变微生物与宿主之间的相互作用[39]。尽管目前普遍认为溃疡性结肠炎中肠环境平衡的破坏是显著发生的，但是造成肠道平衡紊乱的生物学机制的仍然未知，并且不清楚这种紊乱究竟是造成溃疡性结肠炎的原因还是结果。
本研究仍存在不足。首先，肠道微生态对溃疡性结肠炎的保护作用的详细机制仍未探究清楚，特别是肠道中存在的主要4类微生物群（拟杆菌，厚壁菌，放线菌，变形杆菌）对溃疡性结肠炎的作用还有待证实。其次，肠上皮特异性Metrnl敲除后通过调节肠道菌群的组成，从而加重3%DSS诱导的溃疡性结肠炎的作用证据仍不十分充分，需要今后在进一步的研究中加以阐明。
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图 1 各组屈光度随时间变化值
A.空白对照组；B.生理盐水组；C.1%阿托品组；D.0.01%阿托品组；E.优化组1；F.优化组2* P <0.05、** P <0.01，与实验前比较; # P <0.05、## P <0.01，与实验第2周末比较
图 2 眼轴长度随时间变化
A.空白对照组；B.生理盐水组；C.1%阿托品组；D.0.01%阿托品组；E.优化组1；F.优化组2*P <0.05、** P <0.01，与实验前比较;# P <0.05、## P <0.01，与实验第2周末比较
表 1 各组模型眼脉络膜厚度
组别 脉络膜厚度（l/μm） 空白对照组 72.25±3.30**## 生理盐水组 33.60±2.19 1%阿托品组 57.00±1.73 0.01%阿托品组 41.00±4.08**## 优化组1 48.67±0.58**## 优化组2 51.33±2.52**# * P<0.05、** P<0.01，与空白对照组比较; # P<0.05、## P<0.01，与1%阿托品组比较 
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表 2 各组模型眼巩膜厚度
组别 巩膜厚度（l/μm） 空白对照组 91.03±1.68**## 生理盐水组 39.17±2.15 1%阿托品组 74.4±1.95** 0.01%阿托品组 54±2.99**## 优化组1 63.43±2.10**## 优化组2 67.40±2.79**# * P<0.05，** P<0.01，与空白对照组比较; # P<0.05，## P<0.01，与1%阿托品组比较。
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