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延胡索为罂粟科植物延胡索（Corydalis yanhusuo W.T.Wang）的干燥块茎，主产地为浙江、安徽、江苏等地，中医药应用历史悠久。其具有活血、行气、止痛之功效，用于胸胁，脘腹疼痛，胸痹心痛，经闭痛经，产后淤阻，跌扑肿痛[1]。现代科学研究发现延胡索主要含有生物碱、有机酸、甾体、挥发油、糖类、氨基酸等活性成分[2-3]，具有镇痛、镇静催眠、抗溃疡、抗菌、抗炎、抗肿瘤、扩张冠状动脉，增加冠脉血流量，抑制血小板聚集，抗心律失常，改善心肌供氧，增加心输出量等药理作用[4]。含延胡索的中药处方及延胡索乙素制剂广泛应用于胃痛、伤痛、心绞痛、痛经等多种痛症。延胡索临床应用常以炮制品入药，目前常用的炮制方法主要有炒制、醋制、酒制等[5]，其中又以醋制为主，醋制可以提高主要活性成分延胡索乙素的含量[6-7]，《中国药典》（2015年版）收载醋制延胡索为醋炙和醋煮，醋蒸法始载于明代卢之颐的《本草乘雅半偈》，但药典及其他炮制规范等地方标准也无收载。本实验是在《安徽省中药饮片炮制规范》（2019年版）修订课题的基础上完成，实验数据及操作过程，符合中药标准制定规范要求。
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超声波清洗仪（德国Elma公司）；分析天平（METTLER TOLEDO公司）；多功能振荡器（山东申仪电子科技有限公司）；高温箱型电炉、数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）；普利菲尔超纯水机（上海富诗特仪器设备有限公司）；赛默飞U3000系列液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）。
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本实验共收集10批延胡索药材，经海军军医大学药学系中药鉴定学教研室张成中老师鉴定为罂粟科植物延胡索的干燥块茎。延胡索乙素（中国食品药品检定研究院，批号：110726-201516，纯度：99.8%）；食用醋（江苏恒顺醋业股份有限公司）；自制超纯水；色谱级甲醇、氨水（国药集团）。
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取净制、切制后的延胡索，大小分档，加醋拌匀、润透，置蒸制容器内，用蒸汽加热蒸透、内无硬心，取出，干燥。炮制操作主药与辅料按延胡索与米醋的质量比为100∶20(kg/kg)制备醋蒸延胡索。
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取10批醋蒸延胡索分别编号为CYHS-01-01～10，观察其大小、形状、色泽、质地、气、味等总结其共性特征。本品呈不规则的圆形厚片，表面黄褐色，有不规则网状皱纹。质硬而脆，断面黄褐色，角质样，有蜡样光泽。微具醋香气，味苦。
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取醋蒸延胡索粉末1 g，参照《中国药典》（一部）2015年版延胡索薄层鉴别项下制备供试品溶液。另取延胡索对照药材l g，同法制成对照药材溶液。再取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每l ml含0.5 mg 的溶液，制成对照品溶液。吸取上述3种溶液各2～3μl分别点于用1%氢氧化钠溶液制备的同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-丙酮（9∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中显色约3 min后取出，待板上吸附的碘挥尽后，置紫外光灯（365 nm）下检视。从色谱图上可以看出，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点和荧光斑点（图1）。
图 1 醋蒸延胡索薄层色谱图
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参照《中国药典》（四部）2015年版0832水分测定法第二法共测定10批次醋蒸延胡索饮片，水分最低值11.87%，最高值15.74%（表1），根据数据及公式μ=
$ \bar x $ + ts/$\sqrt{n} $ +MU[注：$\bar x $ 是样本的平均数；t是置信水平为99%的学生t检测值(单尾)；s是样本的标准偏差；n是样本的批数；MU是不确定度评估（MU=0.1270×$\bar x $ ）]计算，限度应为15.61%，参照《中国药典》（一部）2015年版延胡索项下，拟定水分限度不得超过15.0%。表 1 10批醋蒸延胡索水分测定结果（%）
序号 含水量A 含水量B 平均值 相对偏差 CYHS-01-01 13.62 13.45 13.54 0.63 CYHS-01-02 12.12 12.35 12.24 0.94 CYHS-01-03 12.39 12.62 12.51 0.92 CYHS-01-04 12.15 12.04 12.10 0.45 CYHS-01-05 12.50 12.15 12.33 1.42 CYHS-01-06 14.09 13.86 13.98 0.82 CYHS-01-07 11.97 11.76 11.87 0.88 CYHS-01-08 16.09 15.38 15.74 2.26 CYHS-01-09 12.40 12.06 12.23 1.39 CYHS-01-10 13.07 12.72 12.90 1.36 -
参照《中国药典》（四部）2015年版2302灰分测定法共测定10批次醋制延胡索饮片，总灰分最低值2.77%，最高值3.80%（表2），根据数据参照《中国药典》（一部）2015年版延胡索项下，根据公式μ=
$\bar x $ +ts/$\sqrt{n} $ +MU计算，限度应为：3.53%，参考《中国药典》（一部）2015年版延胡索项下总灰分限度，拟定不得超过4.0%。表 2 10批醋蒸延胡索总灰分测定结果（%）
序号 灰分A 灰分B 平均值 相对偏差 CYHS-01-01 3.15 3.04 3.10 1.78 CYHS-01-02 2.76 2.80 2.78 0.72 CYHS-01-03 2.89 2.93 2.91 0.69 CYHS-01-04 3.78 3.82 3.80 0.53 CYHS-01-05 2.88 2.95 2.92 1.20 CYHS-01-06 2.74 2.79 2.77 0.90 CYHS-01-07 3.24 3.20 3.22 0.62 CYHS-01-08 3.20 3.23 3.22 0.47 CYHS-01-09 3.25 3.29 3.27 0.61 CYHS-01-10 3.22 3.19 3.21 0.47 -
按照《中国药典》（四部）2015年版2201醇溶性浸出物测定法热浸法，用稀乙醇作溶剂，共测定10批次醋延胡索浸出物， 10批醋延胡索的浸出物在11.68％～18.20％之间（表3）。以统计学方法分析测试数据, 基于测试数据, 设定浸出物限度的公式如下：μ=
$\bar x $ −ts/$\sqrt{n}$ −MU（其中，$\bar x $ 是样本的平均数；t是置信水平为99%的学生t检测值（单尾）t0.01,9=2.821；s是样本的标准偏差；n是样本的批数；MU是不确定度评估MU=0.1413×$\bar x $ ）。浸出物测定限度为：10.41%。拟定醇溶性浸出物测定法，参照《中国药典》2015年版（四部）2201测定，用稀乙醇作溶剂，浸出物不得少于11.0%。表 3 10批醋蒸延胡索浸出物测定结果（%）
序号 浸出物A 浸出物B 平均值 相对偏差 CYHS-01-01 13.69 13.48 13.59 0.77 CYHS-01-02 18.51 18.20 18.36 0.84 CYHS-01-03 14.06 14.15 14.11 0.32 CYHS-01-04 13.87 13.67 13.77 0.73 CYHS-01-05 14.39 14.05 14.22 1.20 CYHS-01-06 16.46 16.21 16.34 0.77 CYHS-01-07 14.66 14.50 14.58 0.55 CYHS-01-08 11.43 11.68 11.56 1.08 CYHS-01-09 13.68 13.79 13.74 0.40 CYHS-01-10 11.78 11.92 11.85 0.59 -
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺调pH至6.0）（55∶45）为流动相；检测波长为280 mn。理论板数按延胡索乙素峰计算应不低于3 000。
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取P2O5减压干燥12 h后延胡索乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含46 μg的溶液，即得。
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取醋蒸延胡索粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入浓氨试液-甲醇（1∶20）混合溶液50 ml，称定重量，浸渍1 h后加热回流1 h，放冷，再称定重量，用浓氨试液-甲醇（1∶20）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 ml，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
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分别精密吸取延胡索乙素对照品溶液与醋蒸延胡索供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得（图2、图3）。
图 2 延胡索乙素对照品色谱图
图 3 醋蒸延胡索样品色谱图
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精密称取纯度为99.8%的延胡索乙素对照品适量置50 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液储备液，分别精密量取一定量的对照品储备液稀释成浓度分别为0.0101、0.0202、0.0404、0.0809、0.1213、0.1618 mg/ml的对照品溶液，注入液相色谱仪，测定含量，以浓度为纵坐标、峰面积为横坐标得标准曲线Y=931.64X+5.1405 (r=0.99995)。
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取CYHS-01-010样品约0.5 g，精密称定，按供试品溶液制备方法处理，测定含量，平行取样测定6次，计算每次测定延胡索乙素的含量为0.097%，RSD为2.4%，符合要求。
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精密称取延胡索乙素对照品溶液10 μl注入液相色谱仪，测定峰面积，平行测定8次，计算RSD为1.1%，符合要求。
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取CYHS-01-010样品约0.5 g，精密称定，按供试品溶液制备方法处理，分别在0、2、4、6、8、12、24 h测定含量，计算每次测定延胡索乙素的RSD为1.8%，符合规定。
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取CYHS-01-010样品约0.25 g，精密称定，精密加入含延胡素乙素0.202 2 mg的对照品溶液，按供试品溶液制备方法处理，得相关溶液，进液相色谱仪处理，计算含量及加样回收率，理论要求加样回收率85%～110%（CYHS-01-010含量为0.097%），RSD<5%（表4）。
表 4 加样回收率试验结果
编号 取样量（m/g） 加样量（m/mg） 回收率（%） RSD（%） 1 0.2418 0.2022 100.4 3.3 2 0.2417 0.2022 106.7 3 0.2427 0.2022 104.6 4 0.2462 0.2022 105.7 5 0.2453 0.2022 100.0 6 0.2440 0.2022 98.5 -
测定10批样品，根据数据计算，结果参照《中国药典》（一部）2015年版延胡索项下制订，拟定含量限度为：不得少于0.050%（10批检品含量差别不大，最大值与最小值差别接近1倍），见表5。根据公式μ=
$\bar x $ -ts/$\sqrt{n} $ -MU计算，限度应不得少于0.060%，醋蒸为醋制延胡索的一个炮制规格，结合《中国药典》（2015年版）一部延胡索项下的含量限度，设定按干燥品计算，延胡索乙素（C21H25NO4）不少于 0.050%。表 5 10批醋蒸延胡索含量测定结果
样品 含量（%） 平均值（%） CYHS-01-01 0.064 0.077 CYHS-01-02 0.068 CYHS-01-03 0.055 CYHS-01-04 0.058 CYHS-01-05 0.072 CYHS-01-06 0.092 CYHS-01-07 0.068 CYHS-01-08 0.100 CYHS-01-09 0.098 CYHS-01-10 0.098 -
辛、苦、温，归肝、脾经。具有活血，行气，止痛之功。性味与归经、功能与主治、用法与用量、储藏等项目参照现行版《中国药典》（一部）2015年版延胡索项下制定。
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蒸法炮制药材早在2000多年前的医药文献《五十二病方》中就有“陈藿，蒸而取其汁”记载，汉代张仲景的《伤寒论》中有“乌梅...蒸之”，至明代缪希雍《炮炙大法》中已有近百味药材的蒸制记载。蒸法的广泛应用使其成为中药炮制最常用的炮制工艺之一。中药延胡索的炮制在宋代出现了醋炒、醋煮、盐炒等工艺，及至明清时又出现了醋纸煨、酒煮等工艺，延胡索醋蒸始载于明代《本草乘雅半偈》“醋润，蒸之，从巳至亥，俟冷取出，焙干，研细用”。现在主要炮制方法为醋炙、醋煮、酒炙、醋蒸等，醋蒸延胡索临床上虽广泛应用，但尚缺法定质量标准。
延胡索经过醋炙后，饮片中延胡索乙素的含量较醋炙前变化较小，但醋炙后延胡索煎剂中延胡索乙素的含量变化较大，溶出会显著增加，表明延胡索醋制后大量生物碱和醋酸反应生成生物碱盐，可提高煎出量，继而提高延胡索止痛作用[8-9]。江国荣等将延胡索生品分别经醋炙、醋煮、醋烘、酒炙后，测定生物碱的含量，发现延胡索经不同炮制后生物碱含量均有所升高，说明临床上可以根据治疗需要，对延胡索采用醋烘、醋炙、酒炙等炮制方法来提高有效成分的含量[10]。李春等采用正交试验法优化延胡索醋蒸炮制工艺，以延胡索粗粉为原料，加醋量30%，闷润2 h，蒸制2 h后，延胡索乙素的含量明显提高[11]。郑军献等对新采集的延胡索进行加工炮制，发现通过不同炮制方法制备延胡索药材，水煮法、蒸制法、烘干法在外形、性状基本一致，但延胡索乙素及成品折干率相差较大，蒸制延胡索乙素含量比水煮高出16.35%，成品折干率比煮法高出3.52%，说明蒸制法优于水煮法。蒸制时间10 min，延胡索乙素含量达到最高，当蒸制时间延长时，其含量反而降低[12]。龙全江等研究发现，经煮制加工的延胡索药材样品中3 种生物碱的含量总体低于蒸制加工所得的延胡索药材，其结果为延胡索药材蒸制炮制工艺的确定提供了物质基础和研究依据 [13]。
在现有文献的基础上，经实验研究分析，醋蒸延胡索具备现行版《中国药典》一部收载的醋炙延胡索质量要求，且延胡索乙素的含量明显高于药典中醋炙延胡索的要求，延胡索乙素可以作用于中枢神经系统，止痛、镇静，降低成瘾性、保护大脑的作用；也可以作用于心血管系统，抗心律失常、改善血流动力学、降低血脂[14]。延胡索乙素含量的增加符合醋制增强行气、止痛之功的炮制目的。因此制定醋蒸延胡索质量标准要求应为：性状为不规则的圆形厚片，表面黄褐色，有不规则网状皱纹。质硬而脆，断面黄褐色，角质样，有蜡样光泽，微具醋香气，味苦；水分不超过15%；总灰分不超过5%；以稀乙醇作溶剂，浸出物不少于11.0%；延胡索乙素（C21H25NO4）含量，按干燥品计算不少于 0. 050%。
Study on quality standard for vinegar-steamed Corydalis rhizoma
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摘要:
目的 制定符合《中国药典》要求的醋蒸延胡索质量标准，用于延胡索醋蒸炮制品种的生产、监督、流通及使用等各环节的质量控制。 方法 参照《中国药典》（四部）2015年版通用检测方法分别对醋蒸延胡索的水分、总灰分、浸出物、主要有效成分含量进行测定。 结果 依据中药质量标准制定指导原则及相关检测方法，根据实验数据，醋蒸延胡索呈不规则的圆形厚片，表面深黄色或黄褐色，有不规则细皱纹。质较硬，断面黄色或黄褐色，角质样，有蜡样光泽，微具醋香气，味苦。其水分含量不超过15.0%，总灰分不得超过4.0%，醇溶性浸出物不少于11.0%，按干燥品计算，含延胡索乙素（C21H25NO4）不少于0.050%。 结论 实验所建立的醋蒸延胡索质量标准符合国家有关中药饮片质量标准制定要求，能够以标准的形式对醋蒸延胡索的质量进行控制。 Abstract:Objective To set up the quality standards for vinegar-steamed Corydalis rhizome, which can be used for the quality control of production, supervision, circulation and application of the steam processed Corydalis rhizoma with vinegar. Methods The moisture content, total ash, ethanol extract content and active ingredients of the steam processed Corydalis rhizoma with vinegar were determined according to the related assay method in Part IV of Chinese Pharmacopeia 2015. Results According to the guidelines from the traditional Chinese medicine quality standards and related testing methods, the moisture content of steam processed Corydalis rhizoma with vinegar should be less than 15.0%, the total ash content less than 4.0%, the ethanol extract content more than 11.0%, and the representative component of tetrahydropalmatine more than 0.05%. Conclusion The established process with this study for the quality standard of vinegar-steamed Corydalis rhizoma was conformed to the state requirements for traditional Chinese medicine. It can be used as a reference for the quality standard of vinegar-steamed Corydalis rhizoma. -
Key words:
- vinegar-steamed Corydalis rhizoma /
- identify /
- quality standard
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新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19），是指2019年始发、由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syn-drome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的肺炎。截至2020年4月5日，全球共确诊COVID-19患者1 093 349例，死亡58 620例[1]。目前尚无针对COVID-19的特异性治疗药物，一些化学药物包括氯喹/羟氯喹、洛匹那韦/利托那韦、瑞德西韦等正在临床开展随机对照研究。临床实践表明，清肺排毒汤和连花清瘟胶囊等多种中药方剂和制剂对COVID-19有良好的治疗效果。据国家卫生健康委员会报道，在我国确诊的COVID-19病例中，有74 187人使用了中医药，占91.5%；中医药能够缓解症状，减少轻型、普通型疾病向重型发展，提高治愈率、降低病死率，总有效率达90%以上[2]。
柴胡达胸合剂，曾用名为“强力肺炎1号”，是国医大师梅国强教授为痰热壅肺证COVID-19患者制定的中药处方[3]。柴胡达胸合剂由小柴胡汤、小陷胸汤、达原饮、止嗽散共同组方，包含柴胡、黄芩、法半夏、全瓜蒌、黄连、枳实、甘草、浙贝母、桔梗、百部、前胡、紫苑、款冬花、槟榔、草果、藿香、佩兰、虎杖共十八味中药。由于临床使用疗效显著，2020年2月23日，湖北省药品监督管理局下发制剂备案批件，包括柴胡达胸合剂在内的2个由湖北省中医院研制的医院制剂获批用于防治COVID-19[4]。
网络药理学是基于系统生物学和多向药理学技术和方法，通过构建“药物-基因-疾病”网络，分析药物在网络中与特定节点相互作用的关系，从整体角度探索药物与机体相互作用的一门学科[5]。2007年，Hopkins首次在Nature Biotechnology杂志上发表述评，提出网络药理学这一概念，并认为其为发现新药的新范式[6]。中药通过多成分、多靶点、多通路对疾病产生治疗作用，利用网络药理学方法，可系统阐明中药治疗疾病的药理作用机制[7]。
因此，本研究运用网络药理学方法，筛选柴胡达胸合剂治疗COVID-19的活性成分和作用靶点，构建“药材-活性成分-靶点”网络图，然后对靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interac-tion, PPI）、GO基因注释和KEGG信号通路分析，为进一步阐明柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 柴胡达胸合剂药材的性味归经、活性成分和靶点的筛选
通过《中华人民共和国药典》（2015年版）手工检索柴胡达胸合剂的十八味中药材的性味归经，利用Cytoscape 3.7.2软件制作“药材-性味归经”网络图。在中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）以柴胡达胸合剂中的十八味中药材名为关键词检索得到所有中药的化学成分。生物利用度（oral bioavailability，OB）和半衰期（half life，HL）是影响药动学的重要参数，而类药性（drug-likeness，DL）可以反映化合物的理化性质与已上市的药物是否类似。根据TCMSP数据库推荐的筛选标准，本研究以OB≥30%，DL≥0.18及HL≥4 h为条件，筛选得到每味中药材的活性成分。同时，通过 TCMSP 数据库查找各活性成分的作用靶点，归纳整理后利用Uniprot 数据库（
https://www.uniprot.org/ ）标准化靶点名称。1.2 “药材-活性成分-靶点”网络图的构建
以coronavirus为关键词，检索GeneCards（
https://www.genecards.org/ ）和OMIM（https://omim.org/ ）数据库获得COVID-19潜在相关基因；利用Venn图在线绘制工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/ ），将柴胡达胸合剂活性成分的作用靶点和COVID-19相关基因取交集，得到柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点；最后，将得到的药材-活性成分-靶点关联性文本导入Cytoscape 3.7.2软件，构建并分析“药材-活性成分-靶点”网络。1.3 PPI网络构建
将柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点导入STRING 蛋白相互作用数据库（
https://string-db.org/ ），物种选定为Homo sapiens，获得PPI信息并导入Cytoscape 3.7.2软件，利用NetworkAnalyzer功能，分析网络中每个靶点的度值（dgree value），使用R软件Graphics包，绘制条形图展示度值排名前20位的靶点。1.4 GO基因注释和KEGG通路分析
利用R软件的org.Hs.eg.db和clusterProfiler包，对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点进行GO基因注释和KEGG通路分析，以P＜0.05进行筛选，得到柴胡达胸合剂对COVID-19发挥治疗作用参与的生物学过程和信号通路，并绘制气泡图展示结果。
2. 结果
2.1 柴胡达胸合剂的药材性味归经
柴胡达胸合剂“药材-性味归经”网络如图1所示，图中节点的大小代表该节点在网络中的度值。由图可知，度值最大的性味归经分别为寒（度值=8）、苦（度值=13）和肺经（度值=14）。
2.2 柴胡达胸合剂的活性成分及其作用靶点
通过TCMSP平台检索到柴胡达胸合剂中的十八味药材共包含1 977个化合物。以OB≥30%，DL≥0.18及HL≥4 h为条件筛选并去重后，共得到221个活性成分。在TCMSP检索活性成分的作用靶点，并到Uniprot数据库中查找其标准名称，最后共得到259个作用靶点。柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息，结果见表1。
表 1 柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息表中药名称 化合物（个） 活性成分（个） 靶点（个） 柴胡 349 14 165 黄芩 143 32 95 法半夏 116 11 70 全瓜蒌 80 7 8 黄连 48 10 153 枳实 65 14 98 甘草 280 76 198 浙贝母 17 4 29 桔梗 102 7 63 百部 110 18 82 前胡 101 11 157 紫菀 91 13 175 款冬花 148 19 155 槟榔 52 3 10 草果 59 5 136 藿香 94 9 147 佩兰 60 6 73 虎杖 62 8 159 2.3 柴胡达胸合剂治疗 COVID-19的作用靶点
通过检索GeneCards和OMIM数据库，共收集得到COVID-19相关基因352个。将柴胡达胸合剂的作用靶点和COVID-19相关基因取交集制作Venn图，共得到51个交集基因，即柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点（图2）。
2.4 “药材-活性成分-靶点”网络
柴胡达胸合剂治疗COVID-19“药材-活性成分-靶点”网络共包含234个节点（药材节点18个，有效成分节点165个，靶点节点51个）。网络中棱形代表药材节点，倒三角代表有效成分节点，圆形代表靶点节点（图3）。节点的颜色越深或节点图形越大，表明该节点在网络中的度值越高。每一圈的最低点为该圈度值最大的节点，度值沿逆时针方向逐渐减小，且3个有效成分节点圈由外往里节点度值依次减小。网络中化合物节点中位数为4，高于2倍中位数的化合物节点共有12个（表2），这些化合物可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要活性成分。
表 2 高于2倍度值中位数的化合物信息表TCMSP数据库ID 化合物名称 对应药材 度值 MOL000098 槲皮素（quercetin） 草果、柴胡、甘草、虎杖、黄连、藿香、款冬花、前胡、紫菀 46 MOL000006 木犀草素（luteolin） 虎杖、桔梗、佩兰、枳实、紫菀 23 MOL000422 山奈酚（kaempferol） 柴胡、甘草、款冬花、紫菀 16 MOL000358 β-谷甾醇（beta-sitosterol） 百部、半夏、浙贝母、虎杖、黄芩、款冬花、前胡、紫菀 15 MOL000173 汉黄芩素（wogonin） 黄芩 14 MOL004328 柚皮素（naringenin） 甘草、枳实 13 MOL002714 黄芩素（baicalein） 半夏、黄芩 10 MOL000497 甘草查尔酮A（licochalcone A） 甘草 10 MOL001689 刺槐素（acacetin） 黄芩、桔梗 10 MOL005828 川陈皮素（nobiletin） 枳实 10 MOL000354 异鼠李素（isorhamnetin） 柴胡、甘草、紫菀 9 MOL005916 葛花苷元（irisolidone） 藿香 9 2.5 PPI网络
在“药材-活性成分-靶点”网络中的靶点节点不包含PPI信息，因此，对柴胡达胸合剂治疗COVID-19靶点进行PPI分析，结果如图4A所示。图中节点形状越大，表明其度值越高，越可能为柴胡达胸合剂治疗COVID-19的核心作用靶点。对网络中度值前30的节点作条形图，节点度值排名前10的蛋白为CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2 和CCL2（图4B）。
2.6 GO基因注释
GO基因注释将基因的功能分为3个部分：参与的生物学过程（biological process，BP），所处的细胞组分（cellular component，CC），执行的分子功能（molecular function，MF）。对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行GO基因注释，以P＜0.05为条件进行筛选，结果得到GO条目共1 722个，其中BP条目1 612个，CC条目30个，MF条目80个。选取每个部分的前5个条目作气泡图，富集最多基因且P值最小的BP、CC和MF条目分别为脂多糖反应、膜筏和细胞因子受体结合（图5）。
2.7 KEGG信号通路分析
对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行 KEGG 信号通路富集分析，筛选出P＜0.05的信号通路156条，选取富集基因最多的10条通路作气泡图。排名前5的信号通路为糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎（图6）。
3. 讨论
COVID-19隶属于中医的“温疫”、“疫病”范畴，病因为感受“异气”、“疠气”，疠气夹湿，病位在肺、脾[3]。柴胡达胸合剂用于痰热壅肺证患者，其病因为痰热互结，壅闭于肺，致使肺失宣降而表现的肺经实热证候。本研究首先对柴胡达胸合剂的十八味中药材进行性味归经的网络分析，结果发现柴胡达胸合剂组方的性味以“苦寒”最多且主归肺经。“苦寒”药能清热泻火，消除热症，多用于具有实热特征病证[8]。因此，柴胡达胸合剂与COVID-19的病机、病位相符。
利用中药、疾病相关数据库，本研究筛选出柴胡达胸合剂治疗COVID-19的165个活性成分和51个作用靶点，表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19具有多成分、多靶点的特点。通过构建和分析“药材-活性成分-靶点”网络图，发现网络中度值较高的12个活性成分：槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、汉黄芩素、柚皮素、黄芩素、甘草查尔酮A、刺槐素、川陈皮素、异鼠李素和葛花苷元。除β-谷甾醇外，其余11个成分均属于黄酮类化合物。
黄酮类化合物广泛存在于自然界的多种植物中，具有包括抗炎、抗动脉粥样硬化和抗肿瘤等多种药理作用[9]。黄酮类化合物还有良好的抗病毒作用，对流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒和柯萨奇病毒等都有抑制作用[10]。体外实验研究表明，槲皮素和木犀草素均能够抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性，对SARS-CoV 产生抑制作用[11-12]。β-谷甾醇也能抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性[13]。SARS-CoV-2与SARS-CoV基因序列有约80%同源性，两者3CL蛋白酶结构有相似性[14]。此外，分子对接结果发现山柰酚、槲皮素、 黄芩素、 木犀草素、 汉黄芩素、β-谷甾醇与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶均有较高的结合活性[15]。因此，通过直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性，可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制之一。
通过分析PPI网络发现，CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2、CCL2等在网络中有较高的度值。CASP3基因编码的caspase-3蛋白是细胞凋亡过程中重要的终末剪切酶，研究发现caspase-3蛋白在SARS-CoV病毒引起的组织细胞凋亡过程中发挥了重要作用[16]。MAPK基因编码的丝裂原活化蛋白激酶参与细胞的增殖、分化、迁移及凋亡等多个生物学过程。此外，炎症因子风暴被认为是重症COVID-19患者组织损伤的病理机制之一。SARS-CoV-2病毒在体内激活T细胞，产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-6等细胞因子，随后GM-CSF会进一步激活CD14+CD16+炎性单核细胞，进一步升高IL-6等炎性因子，形成炎症因子风暴，导致严重的肺部和其他器官免疫损伤[17]。细胞因子根据其在炎性反应中的作用不同可分为促炎性细胞因子（如 IL-1、IL-6、IFN-α、IFN-γ、TNF-α 等）和抑炎性细胞因子（如 IL-4、IL-10 等）两类。SARS患者的肺部炎症和肺损伤与患者血浆中的IL-1B、IL-6、IL-12等促炎性细胞因子水平升高引起炎症因子风暴有关[18]。同样地，COVID-19患者血浆IL-1B、IFN-γ、CXC趋化因子-10（CXCL-10）等促炎性细胞因子水平也升高[19]。本研究中，IL-6、IL-10和IL-1B均为核心作用靶点。因此，减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平可能也是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制。
对靶点进行GO基因注释的结果表明，柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要生物学过程为脂多糖反应、对源于细菌的分子的反应和氧化应激反应等。脂多糖是G-菌细胞壁的组成成分，可诱导细胞产生炎性反应，其中促炎性细胞因子发挥了重要介导作用。IL-6可促进B细胞分化，并活化MAPK，激活STAT转录因子，从而加重炎性反应[20]。KEGG分析富集到156条信号通路，主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎，表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19多通路的特点。
综上所述，本研究采用网络药理学方法，初步揭示了柴胡达胸合剂可能一方面通过多种黄酮类化合物和β-谷甾醇直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性，另一方面通过多成分、多靶点、多通路减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平，从而对COVID-19产生治疗作用。
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图 1 醋蒸延胡索薄层色谱图
注：从左至右各点分别为：S1.延胡索对照药材；T1.CYHS-01-001；T2. CYHS-01-002；T3.CYHS-01-003；T4.CYHS-01-004；T5.CYHS-01-005；S2.延胡索乙素对照品；S1.延胡索对照药材；T6.CYHS-01-006；T7.CYHS-01-007；T8.CYHS-01-008；T9.CYHS-01-009；T10.CYHS-01-010；S2.延胡索乙素对照品。
表 1 10批醋蒸延胡索水分测定结果（%）
序号 含水量A 含水量B 平均值 相对偏差 CYHS-01-01 13.62 13.45 13.54 0.63 CYHS-01-02 12.12 12.35 12.24 0.94 CYHS-01-03 12.39 12.62 12.51 0.92 CYHS-01-04 12.15 12.04 12.10 0.45 CYHS-01-05 12.50 12.15 12.33 1.42 CYHS-01-06 14.09 13.86 13.98 0.82 CYHS-01-07 11.97 11.76 11.87 0.88 CYHS-01-08 16.09 15.38 15.74 2.26 CYHS-01-09 12.40 12.06 12.23 1.39 CYHS-01-10 13.07 12.72 12.90 1.36 
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表 2 10批醋蒸延胡索总灰分测定结果（%）
序号 灰分A 灰分B 平均值 相对偏差 CYHS-01-01 3.15 3.04 3.10 1.78 CYHS-01-02 2.76 2.80 2.78 0.72 CYHS-01-03 2.89 2.93 2.91 0.69 CYHS-01-04 3.78 3.82 3.80 0.53 CYHS-01-05 2.88 2.95 2.92 1.20 CYHS-01-06 2.74 2.79 2.77 0.90 CYHS-01-07 3.24 3.20 3.22 0.62 CYHS-01-08 3.20 3.23 3.22 0.47 CYHS-01-09 3.25 3.29 3.27 0.61 CYHS-01-10 3.22 3.19 3.21 0.47
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表 3 10批醋蒸延胡索浸出物测定结果（%）
序号 浸出物A 浸出物B 平均值 相对偏差 CYHS-01-01 13.69 13.48 13.59 0.77 CYHS-01-02 18.51 18.20 18.36 0.84 CYHS-01-03 14.06 14.15 14.11 0.32 CYHS-01-04 13.87 13.67 13.77 0.73 CYHS-01-05 14.39 14.05 14.22 1.20 CYHS-01-06 16.46 16.21 16.34 0.77 CYHS-01-07 14.66 14.50 14.58 0.55 CYHS-01-08 11.43 11.68 11.56 1.08 CYHS-01-09 13.68 13.79 13.74 0.40 CYHS-01-10 11.78 11.92 11.85 0.59
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表 4 加样回收率试验结果
编号 取样量（m/g） 加样量（m/mg） 回收率（%） RSD（%） 1 0.2418 0.2022 100.4 3.3 2 0.2417 0.2022 106.7 3 0.2427 0.2022 104.6 4 0.2462 0.2022 105.7 5 0.2453 0.2022 100.0 6 0.2440 0.2022 98.5
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表 5 10批醋蒸延胡索含量测定结果
样品 含量（%） 平均值（%） CYHS-01-01 0.064 0.077 CYHS-01-02 0.068 CYHS-01-03 0.055 CYHS-01-04 0.058 CYHS-01-05 0.072 CYHS-01-06 0.092 CYHS-01-07 0.068 CYHS-01-08 0.100 CYHS-01-09 0.098 CYHS-01-10 0.098
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