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啮齿类动物暴露于各种环境和实验等应激刺激条件下，产生许多行为和生理性应激反应[1-2]。应激刺激可致啮齿类动物痛阈升高，痛觉敏感性降低而诱发镇痛，即应激镇痛。测定痛阈的方法有压尾法、甩尾法、热板法和压脚法等[1]。根据应激刺激的特点（如应激源，持续时间，强度和时间模式），镇痛可能由内源性阿片系统或其他非阿片的激素和神经生化机制调解[2-3]。
旋转刺激可诱发啮齿类动物发生晕动病症状，例如异食癖，条件性厌食症，自发活动减少和激素水平变化等[4-6]。肾上腺酮等激素水平的升高，提示某些前庭刺激，如旋转亦可诱发啮齿类动物应激镇痛反应，引起应激镇痛的旋转亦是诱发啮齿类动物晕动病的有效前庭刺激条件。可见，以角加速度为主的平面旋转刺激，可诱发小鼠晕动病和应激镇痛反应。因此，研究旋转诱发的晕动病与应激镇痛之间功能联系的机制非常有意义[7-8]。二者都是通过相同的前庭刺激引起的，反应程度都依赖于应激刺激强度、类型和持续时间等。而且，重复的旋转刺激易致小鼠对镇痛耐受和晕动病的习服。
本实验以热板潜伏期为指标，在以角加速度为主的水平旋转刺激下，观察了化学迷路切除对小鼠旋转诱发的应激镇痛和吗啡镇痛的影响。
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吗啡原料（青海制药厂）；纳洛酮原料（北京四环药厂）；对氨基苯胂酸（Sigma公司）。
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健康昆明种小鼠，雌性，体重：18～22 g。小鼠为清洁级，实验动物质量合格证号：SCXK（沪）2002－0002，由复旦大学医学院实验动物部提供。
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小鼠旋转仪：由控制装置和旋转装置两部分组成。控制装置可调节并显示旋转装置的旋转速度、旋转时间和变速周期。本实验选择转速250 r/min，旋转时间1 min，变速周期为每旋转15 s停止5 s。
旋转装置位于控制装置上方，为一可旋转的方形有机玻璃板（21 cm×21 cm×0.2 cm），旋转转盘的对角线的四角排列着4个可以容纳小鼠的三角形有机玻璃小盒，小盒中心距离旋转轴心均为10 cm。在250 r/min转速下，旋转时小鼠头朝向离心端，旋转半径为10 cm。
热板仪：由电热恒温水浴锅和热板组成。电热恒温水浴锅可程控设置，并显示水浴温度，温度控制精确到0.1 ℃。热板为紫铜板焊接而成的25 cm×14 cm×7 cm（长×宽×高）的槽形体，底部嵌入水浴水面下5 cm，以保证热板受热充分而均匀，由于浮力使热板槽卡紧在水浴锅中。
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应用小鼠旋转仪和热板仪。热板的水浴指示温度为（55.0±0.5）℃。实验时室温维持在23～25 ℃，环境湿度和照明度等应控制相对恒定，减小系统误差。实验时旋转刺激前先测定2次小鼠热板反应时间（即放入热板至首次舔后足时间）取其平均值作为基础潜伏期，挑选基础潜伏期在10～20 s的小鼠作为实验动物，2次测定间隔至少5 min。旋转后热板反应时间在30～50 s较合适。如舔后足潜伏期超过60 s，应中止热板刺激，以免烫伤足底。
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取雌性小鼠32只，随机分为4组，每组8只：①吗啡（5 mg/kg，sc）+生理盐水（10 ml/kg，ip）；②吗啡（5 mg/kg，sc）+纳洛酮（4 mg/kg，ip）；③生理盐水（10 ml/kg，ip）+旋转刺激；④纳洛酮（4 mg/kg，ip）+旋转刺激。①②组小鼠给药15 min后即刻测定热板潜伏期；③④组小鼠给药15 min后开始旋转，旋转结束后即刻测定热板潜伏期。
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取雌性小鼠20只，随机分为2组，每组10只，即生理盐水对照组（10 ml/kg，sc）和吗啡组（5 mg/kg，sc）。每天给药2次（上午9时，下午4时），连续给药7 d。d0、d1、d3、d5和d7下午给药15 min后分别测定小鼠热板潜伏期。首次给药前（d0）和末次给药后（d7）15 min分别测定旋转后小鼠热板潜伏期。
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取雌性小鼠16只，随机分为前庭损伤组（对氨基苯胂酸钠）和假损伤组（生理盐水），每组8只。取0.3 mol/L的NaHCO3溶液加至100 mg/ml的对氨基苯胂酸溶液中，调节pH中性即可形成对氨基苯胂酸钠溶液。动物经戊巴比妥钠麻醉后，注射针穿过鼓膜向鼓室内注射对氨基苯胂酸钠溶液或生理盐水0.04～0.06 ml，注射完毕后用火棉胶紧紧塞住以防药液渗漏。监测动物直到麻醉苏醒可放入饲养笼恢复3～5 d。
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将小鼠置于去芯的50 ml注射器外管中使其呈仰卧位。正常小鼠能感受体位颠倒，并且在数秒内翻正颠倒的体位；前庭损伤小鼠则难以感受颠倒的体位而不能翻转或体位翻正时间延长。实验中观察并记录小鼠翻正反射恢复时间。
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将小鼠置于20 cm × 40 cm的盛水容器中，温度控制在(23 ± 2)℃，观察小鼠在60 s内头部露出水平面游泳的时间。正常动物可在60 s内一直保持头部露出水面游泳，而前庭损伤者头部常难以浮出水面。
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前庭功能评价后，先测定2次小鼠热板反应时间取其平均值作为基础潜伏期。然后，测定前庭损伤和假损伤小鼠旋转后热板潜伏期。
最后，观察迷路切除对吗啡镇痛作用的影响。给予吗啡（5 mg/kg，sc）15 min后测定前庭损伤和假损伤小鼠热板潜伏期。
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数据以均数±标准差(
$ \bar{x}\pm s $ )表示。采用SPSS 13.0统计软件进行多元方差分析（MANOVA）和单因素方差分析（LSD法）、t检验，α=0.05视为检验水准。 -
同时注射吗啡和纳洛酮15 min后，小鼠热板潜伏期显著低于生理盐水对照组（P<0.01），纳洛酮显著降低了吗啡组小鼠热板潜伏期。旋转刺激后，纳洛酮组小鼠热板潜伏期与生理盐水组比较无统计学意义（P>0.05），结果见图1。
图 1 纳洛酮对吗啡镇痛和旋转诱发应激镇痛的影响（n=8）
本实验结果表明，阿片受体拮抗剂纳洛酮可拮抗吗啡的镇痛作用，但不能拮抗旋转诱发的应激镇痛作用，提示旋转诱发的热板潜伏期延长与吗啡镇痛作用机制可能不同，或旋转诱发的小鼠热板潜伏期延长是可能通过非阿片系统起作用的。
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图2所示，吗啡组小鼠随给药天数增加，热板潜伏期逐渐缩短。d1、d3和d5吗啡组小鼠热板潜伏期显著高于生理盐水组（P<0.01）；d7末次给药后2组小鼠热板潜伏期无统计学差异（P>0.05）。可见，吗啡组小鼠于d7已形成吗啡耐受。
图 2 吗啡镇痛作用和耐受形成(n=10)
图3所示，给药前（d0）和末次给药后（d7），吗啡组和生理盐水组小鼠旋转后热板潜伏期均无统计学差异（P>0.05）。结果提示，吗啡镇痛和旋转诱发的应激镇痛无交叉耐受性。
图 3 旋转刺激对吗啡耐受小鼠热板潜伏期的影响(n=10)
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接触翻正反射试验中，给予对氨基苯胂酸溶液组小鼠在注射器中翻正所需时间显著高于生理盐水组（P<0.01）。游泳试验中，给予生理盐水组小鼠在60 s内一直保持头部露出水面游泳，而给予对氨基苯胂酸组小鼠身体在水中螺旋翻滚，头部难以浮出水面，两组小鼠60 s内头部露出水面游泳时间的差别具有统计学意义（P< 0.01），结果见图4。
图 4 小鼠前庭功能评价(n=8)
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旋转刺激后，假损伤组小鼠自发活动减少而旋转行为增加，而前庭损伤组小鼠自发活动在旋转前后无明显变化。从图5显示，旋转前假损伤组和前庭损伤组小鼠基础潜伏期无统计学意义（P>0.05）；而旋转后前庭损伤组小鼠热板潜伏期显著降低（P<0.01），其数值几乎接近旋转前的基础潜伏期水平（旋转前12.8 s，旋转后13.9 s），而假损伤组小鼠旋转后热板潜伏期为38.3 s（旋转前12.5 s）。结果提示，化学迷路切除可能完全阻滞了旋转诱发的小鼠应激镇痛作用。
图 5 化学迷路切除对小鼠旋转后热板潜伏期的影响（n=8）
注射吗啡15 min后，前庭假损伤组和前庭损伤组小鼠热板潜伏期无统计学意义（P>0.05，图6）。结果提示，化学迷路切除对小鼠吗啡镇痛作用无明显影响。
图 6 化学迷路切除对吗啡镇痛作用的影响(n=8)
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应激是机体在受到各种强烈因素（即应激原）剌激时出现的以交感神经兴奋和垂体-肾上腺皮质分泌增多为主的一系列神经内分泌反应，并由此而引起的各种功能和代谢的改变。一定强度的任何躯体的或情绪的剌激，都可以成为应激原，如创伤、缺氧、疼痛等。啮齿类动物如大鼠或小鼠在电击足底，冷水游泳，固定，掐尾巴，离子辐射，或离心旋转等应激刺激下，痛觉敏感性均减弱，这一现象被称为“应激镇痛”[1, 6-7]。
阿片受体拮抗剂纳洛酮可拮抗吗啡对小鼠的镇痛作用，使小鼠热板潜伏期显著下降。可见，吗啡镇痛是通过阿片系统介导的。而旋转刺激诱发的痛阈上升不能被纳洛酮阻断，即旋转后纳洛酮和生理盐水对照组小鼠热板潜伏期间无显著差异。结果提示，旋转刺激诱发的应激镇痛可能是非阿片系统介导的。此外，旋转刺激对吗啡耐受小鼠应激镇痛的影响实验结果也显示，吗啡耐受小鼠和生理盐水对照小鼠旋转刺激后的热板潜伏期无显著差异，表明吗啡镇痛和旋转诱发的应激镇痛无交叉耐受性，证实旋转诱发的应激镇痛是非阿片系统介导的。因此，旋转诱发的应激镇痛与吗啡镇痛的作用机制可能不同。
诱发晕动病的旋转等前庭刺激条件也可以诱发小鼠应激镇痛，提示旋转刺激诱发的应激镇痛和晕动病效应可能存在共同的中枢机制。前庭器官在晕动病的发生中起着重要作用[12-13]。本实验中小鼠旋转后热板潜伏期显著高于旋转前的热板潜伏期，提示该前庭刺激诱发了应激镇痛，前庭器官在旋转诱发的应激镇痛中也起重要作用。
本实验进一步探讨了前庭器官在小鼠旋转诱发的应激镇痛中的作用。采用内耳注射对氨基苯胂酸溶液对小鼠施行化学迷路切除术[12-13]。游泳行为和翻正反射评估的是半规管和耳石器功能，是能够全面评价前庭功能的两个重要参数。评价小鼠前庭功能的小鼠接触翻正反射和游泳试验结果显示，对氨基苯胂酸组小鼠接触翻正反射时间显著高于生理盐水对照组，而头部露出水面游泳时间显著低于生理盐水对照组，提示对氨基苯胂酸成功损伤小鼠前庭功能，化学迷路切除术成功。
化学迷路切除小鼠旋转后热板潜伏期显著降低，且与旋转前热板潜伏期无明显差异；而正常对照小鼠旋转后热板潜伏期显著高于旋转前，表明化学迷路切除可能完全抑制或阻滞了旋转诱发的应激镇痛。另外，小鼠化学迷路切除与否，对吗啡的镇痛作用无影响，进一步提示旋转诱发的应激镇痛与吗啡镇痛作用机制可能不同，前庭器官在旋转诱发的应激镇痛中作用明显。
总之，动物行为学实验表明，前庭器官在旋转诱发的应激镇痛中起重要作用，而前庭系统究竟如何调节旋转诱发的应激镇痛有待进一步的验证和研究。
Effects of chemical labyrinthectomy on stress analgesia induced by rotation in mice
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摘要:
目的 探讨前庭器官在旋转诱发的小鼠应激镇痛中的作用。 方法 雌性小鼠随机分为吗啡组和旋转组，每组小鼠腹腔注射纳洛酮或生理盐水15 min后，观察给予吗啡或旋转（转速250 r/min，时间1 min，每旋转15 s暂停5 s）刺激后的热板潜伏期。另取小鼠连续7 d皮下注射吗啡形成耐受后，观察吗啡耐受小鼠旋转后的热板潜伏期。最后，内耳注射对氨基苯胂酸损伤小鼠前庭器官，观察化学迷路切除小鼠旋转后的热板潜伏期。 结果 与生理盐水组比较，纳洛酮组小鼠旋转后热板潜伏期无明显变化（P>0.05），皮下注射吗啡后热板潜伏期显著下降（P<0.05）。吗啡耐受小鼠旋转后热板潜伏期与生理盐水组比较无明显变化（P>0.05）。内耳注射对氨基苯胂酸后，小鼠接触翻正反射恢复时间显著增加、游泳能力显著下降（P<0.05），且化学迷路切除小鼠旋转后热板潜伏期显著缩短（P<0.05）。 结论 化学迷路切除完全阻滞了旋转诱发的小鼠应激镇痛。前庭器官在旋转诱发的应激镇痛中起重要作用，且该应激镇痛可能由非阿片系统介导。 Abstract:Objective To investigate the role of vestibular organs on stress analgesia induced by rotation in mice. Methods Female mice were randomly divided into morphine group and rotation group. After 15 minutes of intraperitoneal injection of naloxone or normal saline, the hot plate latency of mice in each group was observed following morphine injection or rotation (250 r/min, 15 s on with 5 s off). After subcutaneous injecting morphine for 7 consecutive days, tolerance was formed and the hot plate latency in morphine-tolerant mice after rotation was observed. P-aminophenylarsonic acid was injected into the inner ear to damage the vestibular organs of the mice and the hot plate latency was observed in chemically labyrinthectomy mice. Results Compared with the normal saline group, the hot plate latency of mice in the naloxone group did not change significantly after rotation (P>0.05), and the hot plate latency decreased significantly after subcutaneous injection of morphine (P<0.05). The morphine-tolerant mice had no significant change in the hot plate latency after rotation compared with the normal saline group (P>0.05). After injection of p-aminophenylarsonic acid into the inner ear, the recovery time of the righting reflex in mice was significantly increased, and the swimming ability was significantly reduced (P<0.05), and the hot plate latency of mice with chemical labyrinthectomy was significantly shortened after rotation (P<0.05). Conclusion Chemical labyrinthectomy completely blocked the rotation-induced stress analgesia in mice. Vestibular organs play an important role in rotation-induced stress analgesia, and this stress analgesia may be mediated by a non-opioid system. -
Key words:
- rotation /
- morphine /
- stress-induced analgesia /
- vestibular organs
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高脂血症是指血液中脂质水平异常，通常表现为总胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)升高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低[1]。高脂血症是心脑血管疾病的重要危险因素，可诱发动脉粥样硬化，导致冠心病、脑卒中、心肌梗死，增加心脑血管疾病的发病率和病死率。因此，预防和控制高脂血症具有重要意义[2]。国内外研究和临床实践证明，血脂异常是可以预防和控制的。胆固醇水平降低可显著减少心肌梗死、缺血性卒中事件、心血管死亡，提高心血管病患者的生活质量，有效减轻疾病带来的负担[3]。据统计全球每年约有3000万人死于高脂血症等脂代谢紊乱疾病，且呈逐年增长趋势[4]。
姜黄素是从姜科植物姜黄的干燥根茎中提取的一种多酚类物质[5]。它被认为是姜黄中最重要一类活性成分，具有一系列药理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、细胞保护和降低血脂等[6]。有研究表明，姜黄素对氧化应激、抑制癌症和炎症的进展有显著疗效[7]。此外，姜黄素的降脂作用也被广泛研究。综上所述，姜黄素可作为一种潜在的候选药物用于控制高脂血症所诱导的疾病，如动脉粥样硬化。众所周知，他汀类药物是一种临床常用的治疗高胆固醇血症和相关动脉粥样硬化疾病的处方药，而目前姜黄素已被证明在降低血浆总胆固醇和甘油三酯方面与他汀类药物疗效相当。然而姜黄素存在溶解度低和渗透差的问题，从而导致其口服给药时药物生物利用度低，对于高脂血、动脉粥样硬化等需要达到一定血药浓度为疗效前提的病症来说，姜黄素的传统剂型与市售剂型均无法达到理想的治疗效果。
本研究前期成功构建了姜黄素纳米乳口服给药系统，改善了姜黄素水溶性差的特性。基于此，本文继续探究了姜黄素纳米乳在大鼠体内的药动学特性，观察其对高脂血症模型大鼠的治疗作用，为姜黄素的临床应用提供更多的理论依据。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Agilent 6410 Triple Quad LC/MS（美国Agilent科技有限公司）；全自动生化分析仪Chemray 240 （深圳雷杜生命科技有限公司）；微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）。
1.2 药品与试剂
姜黄素原料药（批号XC20190521，西安小草植物科技有限公司）；姜黄素对照品（批号1108135-201412，纯度>99.8 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20190418，上海凌峰化学试剂有限公司）；Tween-80（批号2018161，上海凌峰化学试剂有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号18139，上海嘉法狮贸易有限公司）；高脂饲料（批号20036219，常州鼠一鼠二生物科技有限公司）；姜黄素片（批号20190925，美国自然之宝®股份有限公司）；辛伐他汀片（SV，批号J20190011，舒降之®杭州默沙东制药公司）；TG试剂盒（批号2020012）、TC试剂盒（批号2020006）、HDL-c试剂盒（批号2020003）、LDL-c试剂盒（批号2020010，长春汇力生物技术有限公司）；SOD试剂盒（批号20200617）；MDA试剂盒（批号20200720）；肝脏匀浆TG试剂盒（批号20200810）；肝脏匀浆TC试剂盒（批号20200411，南京建成有限公司）；乌来糖（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 TEDIA 有限公司）；水为重蒸水。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，SPF级，体重（180±20）g，海军军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（沪）2019-0004。温度：20~25 ℃；相对湿度：40 %~70 %；饮用水：高压灭菌，符合SPF级动物饮用水标准；光照条件：人工光线，12 h照射，12 h黑暗。
2. 方法与结果
2.1 姜黄素纳米乳的制备
姜黄素纳米乳的处方如下：油相Capryol 90在体系中占比为33.10 %，表面活性剂Tween-80为 34.16 %，助表面活性剂1,2-丙二醇为17.21 %，水相占比为15.52 %。制备方法为：精密称取处方量油相Capryol 90、表面活性剂Tween-80和助表面活性剂1,2-丙二醇，混合置于锥形瓶中，于45 ℃ 恒温搅拌至全溶，称取适量姜黄素原料药，搅拌至原料药完全溶解于上述体系中，冷却至室温后向体系中缓慢滴加蒸馏水至体系变为透明均匀的液体，即得姜黄素纳米乳，测得载药量为0.919 mg/g。对姜黄素纳米乳进行特性表征，结果表明所制备的纳米乳粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（123.5±1.2）nm，PDI为(0.204±0.07)，表明该制剂的粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图1所示。结果表明，纳米乳呈圆整均一的球体或类球体，具明显层状结构，粒径大小约为123.5 nm。
2.2 血浆中姜黄素的LC/MS含量测定方法的建立
2.2.1 色谱质谱条件[8]
色谱条件：色谱柱：Dikma Inspire C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相：乙腈-0.1 %（V/V）甲酸水溶液（70∶30）；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl；柱温：35 ℃。
质谱条件：ESI离子源，正离子化模式，扫描方式为多反应监测（MRM模式），干燥气温度：350 ℃，干燥气流速：10 L/min，雾化压力：35 psi，裂解电压145eV，碰撞能量30 eV，定量离子对为m/z=369.3→286.4和m/z=369.3→177.0。
2.2.2 方法学考察
取7份大鼠空白血浆，每份600 μl，分别加入各浓度姜黄素标准品溶液 600 μl，涡旋震荡2 min，再加入1 000 μl甲醇及2 000 μl乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡5 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。上清液用氮气吹干，1 000 μl甲醇复溶，过0.22 μm针式微孔滤膜，所得滤液即加药血浆样品。同法处理空白血浆。按2.2.1项下条件进样测定，记录色谱图及峰面积。方法学考察表明，血浆中姜黄素在2.00~500.00 ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y = 411.32 X+2071.88（r= 0.999 9）。专属性考察结果表明，血浆内源物质对姜黄素的含量测定没有干扰，方法专属性良好（结果如图2）。低、中、高3个浓度的姜黄素-血浆溶液的日内精密度分别为0.54 %、1.21 %、0.93 %，日间精密度分别为0.91 %、0.76 %、0.42 %。3个浓度血浆中的姜黄素提取回收率分别为72.9.2%、78.3%、80.2%，表明该方法可用于血浆中姜黄素的含量测定。
2.3 姜黄素纳米乳的药动学研究
2.3.1 给药方案
18只大鼠随机分为3组（姜黄素原料药组、姜黄素片剂组、姜黄素纳米乳组），每组6只，适应性饲养3 d后，禁食不禁水12 h。3组大鼠分别给予姜黄素原料药混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）、姜黄素片剂粉末混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）各1 ml，姜黄素纳米乳（31.4 mg/kg，以姜黄素含量计算）2 ml。于灌胃给药后的0、1、2、4、8、12、16、24、30、36 h时眼球后静脉丛取血1 ml，置预肝素化离心管中，上下颠倒混匀后3 000 r/min离心15 min，上清液即为含药血浆样品。吸取含药血浆样品600 μl，照“2.2.2”项下方法处理，上清液照“2.2.1”项下色谱条件进样测定。
2.3.2 药动学参数计算
药动学参数计算通过软件Kinetica 5.0对数据进行分析处理得到，计算结果如图3及表1所示。结果表明，与原料药相比，片剂的相对生物利用度为112.10 %，纳米乳的相对生物利用度为313.47 %。与纳米乳组相比，原料药组的cmax为201.48 %，片剂组的cmax为193.02 %，且平均滞留时间（MRT）比原料药组及片剂组更高（为原料药组的183.52 %，是片剂组的154.21 %），表明纳米乳组具有延缓药物吸收的效果，从而在更大程度上发挥稳定血药浓度，提高药物生物利用度的作用。
表 1 各给药组姜黄素的药动学参数($\bar x $ ±s，n=6)原料药组 片剂组 纳米乳组 cmax (ng/ml) 116.18±11.33 121.27±12.12 234.08±17.55 Tmax (t/h) 2.00±0.00 2.00±0.00 4.00±0.00 AUC0→36(ng·h/ml) 1151.12±125.77 1341.34±103.59 2914.42±323.15 AUC0→∞(ng·h/ml) 1202.71±115.28 1348.77±131.39 3770.15±333.28 t1/2 (t/h) 6.66±0.33 7.52±0.51 12.17±0.35 MRT(t/h) 9.89±0.59 11.77±0.31 18.15±0.38 2.4 药效学研究
2.4.1 动物分组、造模及给药
取SD大鼠56只，进行为期一周的适应性饲养后随机分为空白对照组（n=8）和模型组（n=48），空白组饲喂正常饲料，模型组饲喂定制高脂饲料（饲料含2-硫氧嘧啶0.2 %，可可脂17.18 %，胆固醇1.25%，蔗糖12.5 %，胆盐0.22 %）。整个造模周期为16 d，造模期间每日观察各组大鼠的精神、活动、食量、排便量变化等。结束造模后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于眼球后静脉丛取血1 ml，室温静置30 min，3 000 r/min离心20 min，取上层血清检测各项生化指标（TC、TG、HDL-c、LDL-c）[9,10]。
造模成功后将上述模型组大鼠再随机分为模型组、姜黄素片剂组、阳性药（SV）组和姜黄素纳米乳低、中、高剂量组，每组8只。空白组（A组）及模型组（B组）给予生理盐水5 ml/ (kg·d)；阳性药组（C组）给与辛伐他汀20 mg/ (kg·d)（以辛伐他汀含量计）；姜黄素片剂组（D组）给与姜黄素片 62.8 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计）；姜黄素纳米乳低（E组）、中（F组）、高（G组）3组给药剂量分别为15、30、60 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计），连续21天灌胃给药。第21天给药结束后，各组大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1 ml离心取血清待测。
2.4.2 统计学处理
实验所得数据采用SPSS Statistics 22.0统计软件进行处理，方差齐性检验后，采用单因素方差分析，其中组间比较采用LSD法，两两比较采用独立样本t检验；若方差不齐，采用非参数检验。实验结果均以（
$\bar x $ ±s）表示，P<0.01表示具极显著性差异，P<0.05表示具显著性差异。采用 GraphPad Prism 6 绘制图表。2.4.3 肝脏指数
大鼠颈椎脱臼处死，称定体重后解剖取肝脏，冰PBS洗净血迹，称定肝脏湿重并记录，计算肝脏指数；肝脏指数=肝脏湿重/体重×100 %。
图4为给药前后各组大鼠的体重变化。结果表明，给药3周后，与空白组相比，各组均存在极显著性差异（P<0.001）。给药的前2周纳米乳组的体重均表现出正向增长趋势，而模型组、阳性药组以及姜黄素片剂组体重则呈现负增长情况；给药第3周时，仅姜黄素纳米乳高剂量组的体重出现正向增长，阳性药组以及姜黄素纳米乳低、中剂量组大鼠体重降低幅度略有缩小但仍呈下降趋势。
实验结束后剖取大鼠肝脏，肉眼观察到空白组大鼠的肝脏呈现出鲜红色且有光泽，边缘清晰锐利，质地软，与周围组织无明显黏连；模型组大鼠的肝脏肥大，色泽偏黄，边缘圆钝，质地稍硬，且表面的白色沉积明显，与周围组织黏连明显。各给药组大鼠的肝脏比空白组略大，颜色呈不同程度的泛黄白带红，其中以姜黄素纳米乳中剂量组肝脏的颜色与空白组最为接近。
肝脏湿重：如图5所示，除空白组外，各给药组与模型组间均无显著差异，但各给药组肝脏湿重与空白组均具极显著性差异（P<0.001）；
肝脏指数：如图5所示，除姜黄素纳米乳低剂量组外，其他各给药组与模型组之间均存在显著性差异，表明肝脏指数的降低与药物剂量间存在依赖性。阳性药组和片剂组肝脏指数尚未恢复到正常水平，推测原因可能是阳性药和片剂的给药周期还不能完全抵消造模导致的肝脏增重所致。
2.4.4 HE染色、油红O染色及病理切片
取肝脏左、右外叶上端分别于多聚甲醛中固定，脱水，切片，染色后置于光镜下观察。图6为肝脏的HE染色切片。其中A组肝细胞排列整齐，呈索状，内壁边界清晰，无中性粒细胞浸润，仅有零星小泡性脂肪病变；B组视野内可见明显的弥漫性大泡性脂肪病变，肝细胞肿胀，胞浆基质疏松，淡染，存在严重的气球样病变，可见Mallory小体，肝小叶边界不清，汇管区肿大，呈现中性粒细胞浸润，存在重度的肝细胞脂变率；C组和D组以中轻度脂肪病变为主，脂肪细胞占比显著减少；E组汇管区细胞排列比C、D两组更为整齐，肝细胞整体肿胀程度减轻，大泡性脂肪病变仅存在于Ⅲ带，炎性浸润程度减轻，水样病变减轻；F组和G组以小泡性脂变为主，少见大泡性脂变。
图 6 各组大鼠肝脏病理切片H&E染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；黑色箭头指大泡样脂肪病变，黄色箭头指小泡样脂肪病变，黄色无柄箭头指气球样病变，黑色无柄箭头指Mallory小体。染色结果：空泡为脂滴，细胞核为蓝紫色，细胞质为紫红色。图7为油红O染色切片。A组大鼠肝细胞结构完整，细胞核颜色明显；B组肝细胞存在大片鲜艳脂滴，细胞核萎缩、色浅，存在重度脂肪病变；C组和D组仍存在大片连续脂滴，但汇管区附近脂滴颜色明显变淡；E组Ⅲ带脂滴色浅且小；F组和G组视野内所见均为浅色小脂滴，细胞核体积趋向空白组细胞核体积。
图 7 各组大鼠肝脏病理切片油红O染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；染色结果：脂滴呈橘红色至鲜红色，细胞核呈蓝色。2.4.5 血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平
第21天给药结束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1ml，室温静置2 h后3 000 r/min离心15 min取血清，按试剂盒操作说明检测血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平。
给药3周后，大鼠血清中各生化指标变化如表2所示。与模型组相比，姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量组对TC降低效果均有统计学意义（P<0.001），其中，以中剂量组为佳，低剂量组对LDL-c的改善效果更为明显。对于血清中TG、TC的改善情况，与阳性药组相比，纳米乳低、中、高3个剂量组之间差异无统计学意义（P<0.05）；中、高剂量组TC与HDL比值的降低具有统计学意义（P<0.05），表明血脂比存在纳米乳剂量依赖性。
表 2 大鼠血清中TG、TC、HDL-c、LDL-c的表达水平及TC/HDL-C的变化趋势($\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） HDL-c（mmol/L） LDL-c（mmol/L） TC/HDL 空白组 1.34±0.09 2.90±0.44 0.31±0.10 1.88±0.17 9.35±0.41 模型组 2.88±0.51 12.45±0.13 1.84±0.10 3.56±0.66 6.77±1.14 阳性药组 1.41±0.25## 10.81±0.36## 3.03±0.53# 2.87±0.20## 3.57±0.47 姜黄素片剂组 1.79±0.22## 11.24±1.21 3.42±0.42# 4.08±0.32 3.29±0.89 姜黄素纳米乳低剂量组 1.29±0.20## 8.88±0.73## 2.39±0.62## 2.85±0.33# 3.72±0.57# 姜黄素纳米乳中剂量组 1.44±0.04## 7.68±0.34## 1.94±0.78## 2.57±0.82 3.96±0.36# 姜黄素纳米乳高剂量组 1.38±0.28## 8.89±0.64## 1.83±0.34## 2.85±0.67 4.86±0.49## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 2.4.6 肝脏中TC、TG、MDA、SOD的表达水平
将肝脏分为4份，一份置于−80 ℃冷冻保存，一份按如下步骤处理后待测：冰PBS冲洗肝组织表面血迹→研磨后制成10 %匀浆→离心→取上清液→测定各生化指标。
给药3周后大鼠肝脏匀浆中各生化指标表达水平如表3所示。结果表明，模型组肝脏匀浆中TG、TC表达水平的增幅与空白组相比具有统计学意义（P<0.001）；给药3周后，阳性药组和纳米乳低、中剂量组的TG、TC表达水平与模型组相比均有统计学差异（P<0.001），姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量对大鼠肝脏中TG、TC表达水平的降低均具有统计学意义（P<0.05），其中，低剂量组效果最佳，这也与血清中TC水平变化趋势相一致。
表 3 大鼠肝脏匀浆中TG、TC、SOD以及MDA的变化趋势（$\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot） 空白组 0.42±0.16 0.11±0.03 956.31±142.64 0.47±0.06 模型组 0.69±0.05** 0.09±0.02** 769.26±141.64**## 1.98±0.26** 阳性药组 0.50±0.11*## 0.7±0.01*## 988.25±168.90## 0.64±0.15*## 姜黄素片剂组 0.66±0.10**# 0.04±0.01*## 933.99±103.39# 0.79±0.11** 姜黄素纳米乳低剂量组 0.64±0.07**## 0.06±0.02*## 972.23±142.10## 0.80±0.03**# 姜黄素纳米乳中剂量组 0.58±0.05**## 0.07±0.02**## 916.55±117.32# 0.59±0.09## 姜黄素纳米乳高剂量组 0.54±0.13## 0.10±0.03** 799.81±121.85** 0.70±0.23*## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 超氧化物歧化酶（SOD）是机体内重要的抗氧化酶，能催化自由基清除反应，保护细胞免受自由基的攻击，明显改善肝肾等组织的氧化损伤，能直观的反映体内抗氧化酶的活性[11]。MDA是脂质过氧化反应的产物，反映了自由基的活跃程度，可用于评价机体内脂质过氧化的程度[12]。因此，选择SOD和MDA作为评价高脂血症大鼠肝功能损伤程度的指标。
给药3周后，与模型组相比，阳性药组及姜黄素纳米乳低剂量组均能够上调大鼠肝脏中SOD的表达水平（P<0.001），姜黄素纳米乳中剂量组对其表达水平也有正向影响（P<0.05）；此外，实验中发现，与姜黄素纳米乳低、中剂量组相比，高剂量组对体内SOD的表达呈现出抑制，推测此现象与姜黄素的双向调节机制有关；对于MDA的表达水平，与模型组相比，阳性药组和姜黄素纳米乳各剂量组对其表达的抑制作用均具有统计学意义（P<0.001），但效果仍以中剂量组为佳。
3. 讨论
姜黄素是一种被广泛研究的中药多酚类物质，具有抗氧化、抗炎和降血脂的药理活性。已有报道将他汀类与姜黄素对于改善血脂的功效进行了比较。他汀类药物是治疗高胆固醇血症和高脂血症的一线药物。研究表明，姜黄素在降低甘油三酯(TG)方面最有效，而他汀类药物在降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)方面最有效。姜黄素影响血浆脂质改变的途径与他汀类药物相似[13]。几乎所有胆固醇运输的途径都会受到药物制剂的影响，包括胃肠道对膳食中胆固醇的吸收、肝细胞对血浆胆固醇的清除、胆固醇逆向运输的介质以及从外周组织中清除胆固醇。此外，姜黄素的活性氧(ROS)清除能力降低了脂质过氧化的风险，而脂质过氧化会引发炎症反应，导致心血管疾病(CVD)和动脉粥样硬化[14]。综上所述，姜黄素或可作为一种安全且耐受性良好的他汀类药物辅助药物，更有效控制高脂血症。
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