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荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）是指供体荧光分子发射光谱与受体分子的吸收光谱有显著的重叠且分子间距小于10 nm时发生的一种非放射性的能量转移[1]，导致供体荧光淬灭而受体荧光增强或不变。近些年，FRET技术以其精准高效的特点被广泛应用在分析检测领域，为检测生物分子提供了重要的分析方法。基于FRET技术，实现了活细胞内ATP分子的检测[2]，金属离子如汞离子的检测[3-4]，许多疾病相关基因[5-6]以及酶活性的检测等[7-8]。
银纳米簇（AgNCs），作为一种新型的低毒性“绿色”荧光标记材料，具有量子产率高、毒性低、生物相容性好等特点[9]，使得其被广泛应用在多个研究领域。在银纳米簇的合成过程中，相较于其他的合成模板，DNA更具优势，如DNA具有分子识别的功能（包括对于互补链和小分子的识别），不同序列的DNA模板可调谐不同的发射波长等[10]。
研究发现，G碱基可以增强DNA/银纳米簇（DNA/AgNCs）的荧光强度[11-12]，基于此，我们设计了系列非银簇模板部分的互补链，考察G碱基个数对于银簇荧光强度的影响，实验结果显示，暴露的G碱基个数与银簇的荧光强度呈正相关关系。该实验不仅验证了G碱基对于银簇荧光的增强作用，还提示我们在设计含有G-四联体适配体的荧光探针时，可通过改变非银簇部分的互补链长短来调控荧光的淬灭及恢复程度，以获得最佳的检测效果。
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VS-100C恒温混匀仪（无锡沃信仪器制造有限公司）；FL-6500荧光分光光度计（PerkinElmer）；ZEN3600粒径电位测定仪（英国马尔文公司）；精密电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；Vortex-Genie2多功能旋涡混合器（美国Scientific Industries公司）；TGL-16C离心机（上海安亭科学仪器厂）；实验室pH计 FE20[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；Tecnai G2 F30高分辨率电子显微镜（荷兰FEI公司）
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硝酸银、硼氢化钠、盐酸(国药集团化学试剂有限公司)；三羟甲基氨基甲烷(Tris，大连美仑生物技术有限公司)；氯化镁、氯化钠、氯化钾(上海泰坦科技股份有限公司)；试剂均为分析纯。实验用水为屈臣氏蒸馏水。
相关DNA序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。合成DNA-AgNCs的模板序列及P1A5C5的互补序列如表1、表2所示。
表 1 DNA/AgNCs的模板序列
名称 序列（5′—3′） P1C5 GGAGGTGGTGGGGCCCCCTAATTCCCCC P1AC5 GGAGGTGGTGGGGACCCCCTAATTCCCCC P1A5C5 GGAGGTGGTGGGGAAAAACCCCCTAATTCCCCC P1N GGAGGTGGTGGGGCCCTAACTCCCC P1Y GGAGGTGGTGGGGCCCTTAATCCCC 表 2 P1A5C5的互补序列
名称 序列（5′—3′） 0G CCTCCACCACCCCTTTTT 1G CTCCACCACCCCTTTTT 2G TCCACCACCCCTTTTT 4G TCCACCCCTTTTT 5G CACCCCTTTTT 6G ACCCCTTTTT 7G CCCTTTTT -
加入相应体积的20 mmol/L Tris-HCl（pH=7.4）缓冲溶液将DNA溶解，即制得100μmol/L DNA溶液，将制得的DNA溶液95 ℃加热5 min后，冰水浴冷却10 min。
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参考文献中的合成方法[13]，将一定体积的硝酸银溶液加入到上述DNA溶液中（20 mmol/L Tris-HCl，pH=7.4），充分震荡混匀，25 ℃孵育20 min，静置，将一定体积新配制的硼氢化钠引入到上述反应混合物中，最终使得体系中DNA、硝酸银、硼氢化钠的浓度分别为5、30、30μmol/L（即DNA：Ag+∶NaBH4的摩尔比为1∶6∶6），剧烈震荡混匀，室温下避光反应3 h后，4 ℃避光反应过夜。得到的银纳米簇溶液在4 ℃保存以备用。
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荧光图谱表征：将2μmol/L的银纳米簇溶液在200～800 nm波长范围内进行荧光光谱预扫描，设置激发和发射狭缝宽度为10 nm，扫描速度为1200 nm/min，电压值为400 V。
高分辨率透射电子显微镜表征：将银纳米簇溶液滴加铜网后观察。
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在含有100 mmol/L NaCl,2 mmol/L MgCl2，5 mmol/L KCl的20 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液中（pH=7.4），加入银簇溶液（2μmol/L），将互补的DNA溶液（表2）以1∶1的摩尔比分别加入到上述体系溶液中，充分震荡混匀，37 ℃孵育20 min。在室温条件下进行荧光光谱测量。激发波长为486 nm，激发和发射狭缝宽度为10 nm，扫描速度为1200 nm/min，电压值为400 V。
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在进行DNA/AgNCs的合成时，基于胞嘧啶碱基与银离子的作用，一般选择富含胞嘧啶碱基的序列作为合成模板，笔者根据文献报道的模板序列结合模板优化设计[13-16]，选择了5种银簇模板并进行了相应的碱基优化设计，如表1所示，结果显示P1A5C5的荧光信号强度较高（如图1），且4 ℃避光保存45 d后，荧光信号强度基本不变，稳定性良好。因此，我们使用该序列合成的DNA/AgNCs进行后续的实验研究。
图 1 5种DNA/AgNCs模板序列的荧光图谱表征
对生成的P1A5C5银纳米簇体系进行荧光激发光谱和发射光谱的表征，结果如图2所示，在487 nm激发条件下，发射波长为577 nm。
图 2 P1 A5 C5银纳米簇的荧光图谱表征
DNA/AgNCs的高分辨透射电子显微镜（HRTEM）图片如图3所示，从图中可以看出，DNA/AgNCs的直径约为2~3 nm,分散性良好。
图 3 DNA/AgNCs的高分辨率透射电子显微镜图
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在银簇P1A5C5序列5′-GGAGGTGGTGGGGAAAAACCCCCTAATTCCCCC-3′中，CCCCCTAATTCCCCC为成簇模板序列，下划线部分为岩沙海葵毒素的G-四联体适配体[17]。基于G碱基对银簇的荧光信号强度有增强作用这一现象，我们设计了一系列适配体部分的互补序列（表2），通过C-G碱基互补，适配体部分暴露的G碱基个数不同，导致与银纳米簇作用的碱基G数目不同，进而对银纳米簇的荧光信号强度产生不同的影响。结果显示，随着暴露的G碱基个数的增加，荧光信号强度增加（图4A），对暴露的G碱基个数与荧光信号强度关系进行拟合，得到的线性方程为：Y=1726.1X+8972.5，r=0.9789（图4 B）。该研究证明了G碱基对银簇的荧光具有增强效果，反之，通过C-G碱基互补配对，G碱基与银簇的作用位点被占据，无法与银簇作用，难以达到增强荧光信号强度的作用。因此，随着暴露碱基个数的减少，荧光强度减弱。基于此，可实现与G-四联体适配体有关的荧光开关的设计，进而实现对目标物的检测。
图 4 P1 A5 C5与互补链作用后的荧光光谱图及线性关系图
在DNA序列和银纳米簇进行碱基互补配对时，结合互补序列的Tm值，我们研究了互补链间实现碱基互补配对所需的温度和时间。实验结果显示，相较于4 ℃，在37 ℃条件下孵育，互补链间相互作用较强，容易实现碱基互补配对，荧光信号强度变化较为明显；同时，考察了在37 ℃下作用1 h内的荧光变化情况，结果显示，荧光变化强度随时间未发生明显变化，最终选择20 min作为孵育时间。
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该实验利用含有G四联体适配体的DNA序列合成了荧光银纳米簇，基于G碱基可以增强银纳米簇的荧光这一现象，并结合碱基互补配对的原则，设计了8种G四联体适配体的互补链，在互补链和适配体部分碱基互补配对后，荧光信号强度也产生相应的变化。随着互补链长度的缩短，暴露的G碱基个数增加，荧光信号增强，且暴露的G碱基个数与荧光信号强度拟合得到的线性方程为：Y=1726.1X+8972.5，r=0.9789。该实验不仅证实了G碱基对荧光银纳米簇有荧光增强作用，还提示我们在设计含有G四联体的银纳米簇荧光探针时，可以通过互补链对荧光信号的干扰程度来调控荧光的开闭，这对进一步扩展银纳米簇在荧光分析方法中的应用具有指导意义。
The effect of different guanine base number on fluorescence intensity of DNA/ silver nanoclusters
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摘要:
目的 通过C-G碱基互补配对的方式，考察不同鸟嘌呤碱基(G)数目对DNA/银纳米簇荧光信号强度的影响，以此来探究新的荧光探针开关构建的方法。 方法 利用核酸碱基互补配对原则，设计了一系列银纳米簇的适配体部分的互补序列,考察了银纳米簇的适配体序列中暴露的G碱基个数对荧光信号的影响。 结果 碱基G可增强银纳米簇的荧光信号强度，且荧光信号强度与G碱基个数呈现正相关关系，拟合线性方程为Y=1726.1X+8972.5，r=0.9789。 结论 该实验研究对于调节银纳米簇的荧光强度以及设计适配体为G四联体的荧光探针开关具有借鉴意义。 Abstract:Objective To investigate the effect of different guanine base numbers on the fluorescence intensity of DNA/ silver nanoclusters through C-G base complementary pairing, in order to explore a new method for the construction of fluorescent probe switches. Methods Designed complementary sequences of aptamer parts of a series of silver nanoclusters by using the nucleic acid base complementary pairing principle, and investigated the effect of the number of G bases exposed in the aptamer sequence on the fluorescence signal. Results Base G could enhance the fluorescence signal intensity of silver nanoclusters, and the fluorescence signal strength was positively correlated with the number of G bases. The fitting linear equation was Y=1726.1X+8972.5, r=0.9789. Conclusion This study is a great reference for the regulation of fluorescence intensity of silver nanoclusters and the design of G quadruplet aptamer fluorescent probe switch. -
Key words:
- DNA/AgNCs /
- complementary pairing /
- fluorescence probe /
- aptamer
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针对海训需求，本课题组研制出一款能同时满足防晒和防水母蛰伤需求的防水型多效防护乳，对于增强海军部队日常海训强度和提高海军战斗力具有重要作用和意义。经文献和相关专利调查，以及初步药效学评价[1-5]，本课题确定以LaCl3·7H2O (500 mmol/L)、MgCl2·6H2O(25 mmol/L)、CaCl2(25 mmol/L)的水溶液作为防水母蛰伤成分加入到基质处方中。镧是一种重要的稀土元素，广泛应用与电子、医药、生物医学等领域，有文献报道[6-9]，镧离子暴露可能会导致人的健康问题，对阈值效应而言，需要进行未观察到有害作用剂量（NOAEL）的测定。防护乳长期、大量涂抹，而且很可能接触破损的皮肤，镧离子（La3+）可能通过经皮吸收进入人体体循环，而其在体内的毒性或潜在毒性均未明确。此外，迄今为止，未见含镧乳膏的透皮安全性的报道，所以必须对防护霜中添加的镧离子进行安全性验证。
电感耦合等离子体发射光谱技术具有分析速度快、线性范围宽、可多元素同时测定、检出限低等特性，已被广泛地应用于各类物质中无机元素的分析检测[10]。本文以镧元素为检测对象，结合微波消解与电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）技术，建立一种体内含量分析方法，可为多效防护乳的质量分析和透皮安全性评价提供基础数据。
1. 仪器与材料
1.1 仪器
Thermo Scientific iCAP6000系列电感耦合等离子体光谱仪，包括RF发生器、光谱仪系统和光电转换检测器、iTEVA工作站（美国赛默飞世尔公司）；MDS-6G多通量微波消解/萃取系统（上海新仪微波化学科技有限公司）；AL-104电子天平（瑞士梅特勒公司）；VORTEX-6涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器有限公司）；Barnstead D3750超级纯水仪（美国赛默飞世尔公司）。
1.2 药品与试剂
硝酸（优级纯，批号：20190920）购自国药集团化学试剂有限公司；La元素标准溶液（浓度1000 μg/ml）购自国家有色金属及电子材料分析测试中心；水为超纯去离子水(≥18.2Ω)；多效防护乳（批号：82004163）为中试放大样品。
1.3 实验动物
SD大鼠，均为雄性，体重约250 g，昭衍（苏州）新药研究中心有限公司提供，许可证号（苏）2018-0006。
2. 方法与结果
2.1 全血样品采集
给药前，尽可能剃掉大鼠背部及两侧体毛，约5 cm×10 cm，休息观察24 h。实验前禁食12 h，自由饮水。实验前，将大鼠编号，用丙酮轻轻擦去皮脂。然后以0.4 g/cm2的剂量分别将防护乳均匀涂布在大鼠裸露皮肤表面。分别于给药前和给药后1 h在眼眶静脉丛取血1ml，置于肝素化的离心管中，于−20 ℃条件下保存。
2.2 仪器工作参数
iCAP6000系列电感耦合等离子体光谱仪最佳化后工作条件为：射频功率1150 W；采样深度5 mm；冷却气流量12 L/min；辅助气流量0.5 L/min；泵转速45 r/min。样品冲洗时间30 s；样品测定次数3次。微波消解仪参数和检测程序如表1所示。
表 1 全血样品微波消解程序步骤 温度(T/℃) 保持时间(t/min) 功率(P/W) 1 120 6 800 2 150 5 800 3 180 15 800 2.3 供试品溶液的制备
准确吸取血样1 ml，置于聚四氟乙烯烧杯中，加入硝酸8 ml，混匀，在电热板上于120 ℃加热预消解20 min，血样可完全溶解为黄色的消解液；然后，按照表1程序将样品置于微波消解仪中完全消解。取出样品置于160 ℃的电热板上加热赶去硝酸，消解液呈无色透明或略带黄色，直到四氟乙烯杯剩余溶液小于1 ml时，将消解液转移至10 ml量瓶中，用2%硝酸溶液洗涤容器，洗液合并于量瓶中，用2%硝酸溶液稀释至刻度，摇匀，得到供试品溶液。未经给药处理的血样经过上述消解程序得到的溶液即为空白基质溶液。
2.4 对照品溶液的制备
精密量取La元素标准溶液1 ml，置10 ml量瓶中，用2%硝酸溶液稀释至刻度，得到浓度为100 μg/ml的储备液(A)。精密量取储备液0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5 ml，分别置50 ml量瓶中，用2%硝酸溶液稀释至刻度，摇匀，得到浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/ml的一系列对照品溶液。
2.5 方法学验证
2.5.1 专属性试验
将空白溶液（2%硝酸溶液）、空白基质溶液、对照品溶液和供试品溶液依次注入等离子体光谱仪，检测并记录结果，其图谱如图1所示，结果表明La在333.749 nm处谱线干扰较少，对照品溶液和供试品溶液的峰形较好，空白溶液和空白基质溶液在此谱线无响应，方法的专属性较好。
2.5.2 线性与定量限
将“2.4”项下制备的对照品溶液依次注入ICP-OES，检测并记录结果。结果表明，在0.1～5 μg/ml浓度范围内，仪器响应值与浓度呈良好线性关系，La的线性方程为Y=33730X-774.4，r=0.9998。
将2%硝酸溶液注入ICP-OES进行测试，连续进样11次，以空白溶液响应值标准偏差的3.3倍计算检出限，以空白溶液响应值标准偏差的10倍计算定量限。方法检出限为0.0025 μg/ml，定量限为0.0077 μg/ml。
2.5.3 准确度
精密量取空白血样9份于烧杯中，各1 ml, 分别精密加储备液0.16、0.2、0.24 ml，低、中、高每个浓度平行配制3份。随后按照“2.3”项下样品的处理方法进行制备，即得空白加标溶液。将空白基质溶液和空白加标溶液分别注入仪器，进样分析，结果见表2。La的低、中、高浓度的回收率均在94.9%～102.0%之间，表明本法的回收率良好。
表 2 空白血样加标回收率试验结果加入对照品含量（μg/ml） 空白基质响应值（μg/ml） 测得值（μg/ml） 回收率(%) RSD
(%)1.6 0.0131 1.5354 95.1 0.86 1.6 0.0131 1.5610 96.7 1.6 0.0131 1.5543 96.3 2 0.0131 2.0521 102.0 1.20 2 0.0131 2.0246 100.6 2 0.0131 2.0059 99.6 2.4 0.0131 2.2914 94.9 0.85 2.4 0.0131 2.3231 96.0 2.4 0.0131 2.3272 96.4 2.5.4 重复性
取同一批血样（给药后1 h取血样本）共6份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样分析。结果La含量的RSD为1.01%，表明本法的重复性良好。
2.6 样品测定
4组样品在1 h的取血时点所测得的La的浓度（μg/ml）如表3所示。
表 3 全血样品在给药后1 h测得的镧浓度（μg/ml，n=4）编号 含量（μg/ml） RSD（%） 1 1.770±0.016 0.94 2 2.092±0.012 0.57 3 1.968±0.008 0.44 4 1.885±0.012 0.67 3. 讨论
3.1 镧的安全性
La不是人体必需元素，已有研究表明[7, 9, 11]镧具有潜在的毒性，包括神经行为和认知行为功能障碍，可致肝功能下降，对骨、肾、脾脏、免疫系统均具有负面影响。镧可从农产品通过胃肠道进入人体，但是经皮吸收进入人体体循环的情况尚未可知，未见有La的经皮安全性评价的报道。本次试验建立了La元素的生物样本体内分析方法，为单次涂抹含镧防护乳后24 h的透皮安全性研究提供了新的方法和思路。
3.2 前处理方法的优化
全血中无机元素的分析常通过两种途径：一是以TritonX-100水溶液或去离子水直接稀释进样测定；二是通过传统的干灰化法、湿法消解或微波消解法将血样完全消解后进样测定[12]。由于全血中含有大量蛋白质等物质，直接稀释干扰较多，与湿法、干法消解法相比，微波消解具有加热快、消解完全、消耗试剂少、节能环保等优点[13]，故本研究选择微波消解法对全血样品进行处理。常用的消解溶剂有HNO3、HF、H2O2、HClO4等[14]，本实验采用HNO3，即可将血液样品消解为近无色的澄清液体（消解完全），避免了H2O2、HClO4等易爆溶剂的使用。
3.3 La测定方法的建立
本文通过微波消解-ICP-OES法，建立了生物样本中La的测定方法，该方法操作简单，分析速度快，灵敏度高，准确度好，为多效防护乳中La的含量测定和安全性评价提供依据。
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表 1 DNA/AgNCs的模板序列
名称 序列（5′—3′） P1C5 GGAGGTGGTGGGGCCCCCTAATTCCCCC P1AC5 GGAGGTGGTGGGGACCCCCTAATTCCCCC P1A5C5 GGAGGTGGTGGGGAAAAACCCCCTAATTCCCCC P1N GGAGGTGGTGGGGCCCTAACTCCCC P1Y GGAGGTGGTGGGGCCCTTAATCCCC 
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表 2 P1A5C5的互补序列
名称 序列（5′—3′） 0G CCTCCACCACCCCTTTTT 1G CTCCACCACCCCTTTTT 2G TCCACCACCCCTTTTT 4G TCCACCCCTTTTT 5G CACCCCTTTTT 6G ACCCCTTTTT 7G CCCTTTTT
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