Optimization of the extraction process of Compound Jiangyu Granules prescription crude drugs and in vitro evaluation of anti-lung cancer activity

E2695-2998PDA高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Milli-Q纯水仪（德国Merck Millipore公司）； MF十万分之一电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Z216MK高速温控离心机（德国HERMLE公司）；A 11研磨粉碎机（德国IKA公司）；AdVantage冷冻干燥机（美国VirTis公司）；SB-2000旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；DHG-9203A台式鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；SpectraMax M5酶标仪（美国Molecular Devices公司）；FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）；Eclipse C1荧光显微镜（日本Nikon公司）。

鱼腥草（批号：231208，产地：四川）、望江南（批号：240401，产地：江苏）、太子参（批号：20230719，产地：贵州）、白花蛇舌草（批号：20240303，产地：河南）、黄芪（批号：20240219，产地：内蒙古）、白术（麸炒）（批号：20240531-1，产地：安徽）、陈皮（批号：20240406-1，产地：湖南）、白茯苓（批号：SY240102，产地：云南）、六神曲（炭）（批号：240403，产地：河南）均由复旦大学附属肿瘤医院提供，上述药材经上海中医药大学杨骏教授鉴定；槲皮素（批号：O29HB199514）、熊果酸（批号：C15O11Q126879）、大黄素甲醚（批号：M08IB214534）均购自上海源叶生物科技有限公司；DMEM培养基（Gibco公司）；CCK-8试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；多聚甲醛、结晶紫（Sigma-Aldrich公司）；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；甲醇（质谱级，99.9%，默克）；甲酸[色谱级，≥98%，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；实验用水为 Milli-Q 纯水仪制备的去离子水。

Lewis小鼠肺癌细胞（LLC）购自中国科学院上海细胞库。

分别精密称取槲皮素、熊果酸和大黄素甲醚对照品10 mg于10 ml量瓶中，用甲醇溶解定容，制备浓度均为1 mg/ml的槲皮素、熊果酸、大黄素甲醚对照品储备液，备用。

称取药材鱼腥草10 g、望江南5 g、太子参4 g、白花蛇舌草3 g、黄芪3 g、白术（麸炒）3 g、陈皮3 g、白茯苓3 g、六神曲（炭）3 g，置于1000 ml圆底烧瓶中，取12倍量纯化水浸泡30 min，微沸状态下煎煮2次，药液合并过滤，4℃静置过夜，再次过滤，滤液减压浓缩得到浸膏，再经冷冻干燥处理，即得复方江鱼颗粒提取物干浸膏，干浸膏粉碎，过100目筛备用。精密称取制备的干浸膏800 mg置于10 ml量瓶中，甲醇溶解并定容，得到80 mg/ml的供试品溶液。

色谱柱：Eclipse Plus C₁₈柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；流动相A为含 0.1%甲酸的甲醇，流动相B为 0.1%甲酸水溶液；流速：1.0 ml/min；柱温：25℃；检测波长分别为210 nm（槲皮素和熊果酸）和226 nm（大黄素甲醚）；进样量：20 μl。洗脱梯度：0～10 min，30%～70% A；10～15 min，70%～95% A；15～23 min，95% A；23～25 min，95%～30% A。

分别精密量取40 μl、400 μl、20 μl槲皮素、熊果酸、大黄素甲醚对照品储备液混合，用甲醇稀释至1 ml，配制成最终浓度分别为槲皮素40 μg/ml、熊果酸400 μg/ml、大黄素甲醚20 μg/ml的混合对照品溶液，与供试品溶液和空白甲醇溶液进样分析。检测波长为210 nm条件下的色谱图如图1所示，检测波长为226 nm条件下的色谱图如图2所示。结果显示，混合对照品和供试品中槲皮素、熊果酸和大黄素甲醚色谱峰的保留时间分别在11.80 min、21.65 min和19.79 min，空白甲醇溶液对测定结果无影响，表明专属性良好。

精密量取对照品储备液，用甲醇稀释，配制成槲皮素浓度为1、2、5、10、20、40、80 μg/ml，熊果酸浓度为10、20、50、100、200、400、800 μg/ml，大黄素甲醚浓度为0.5、1、2.5、5、10、20、40 μg/ml的混合对照品溶液进样分析，并以药物浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归。经计算，槲皮素的线性方程为Y=91320 X+8557（r=0.9997），熊果酸的线性方程为Y=8938 X+50858（r=0.9996），大黄素甲醚的线性方程为Y=101431 X-2476（r=0.9999）。结果显示槲皮素在1~80 μg/ml浓度范围内，熊果酸在10~800 μg/ml浓度范围内，大黄素甲醚在0.5~40 μg/ml浓度范围内，药物浓度和吸收峰面积的线性关系良好。

取高、中、低3个浓度的混合对照品溶液，考察仪器精密度。槲皮素浓度分别为80、10、1 μg/ml，熊果酸浓度分别为800、100、10 μg/ml和大黄素甲醚浓度分别为40、5、0.5 μg/ml，一天内对各溶液测定6次，连续测定3天，并记录峰面积。高中低浓度的槲皮素、熊果酸、大黄素甲醚的日内、日间精密度RSD值均小于3%，表明仪器精密度良好。

按照供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件分别进样分析，记录峰面积。结果显示，槲皮素吸收峰面积的RSD值为2.73%，熊果酸吸收峰面积的RSD值为2.79%，大黄素甲醚吸收峰面积的RSD值为1.90%，结果表明该方法的重复性良好。

取同一批供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件，分别测定该溶液于室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h后的色谱峰面积。结果显示，24 h内，槲皮素吸收峰面积的RSD值为2.87%，熊果酸吸收峰面积的RSD值为2.63%，大黄素甲醚吸收峰面积的RSD值为2.19%，表明配制的供试品溶液在24 h内保持稳定。

精密量取上述配制的供试品溶液1 ml置于2 ml量瓶中，并分别加入槲皮素对照品储备液5.04、10.08、15.12 μl，熊果酸对照品储备液8.34、16.68、25.02 μl和稀释10倍的大黄素甲醚对照品储备液3.92、7.84、11.76 μl，溶解过滤后，按“2.1.3”项下色谱条件进样分析，考察采用该色谱条件检测槲皮素、熊果酸和大黄素甲醚的加样回收率。结果表明该测定方法准确性好，可用于样品中槲皮素、熊果酸和大黄素甲醚的含量测定（见表1）。

首先采用单因素试验初步考察溶媒用量、提取时间和提取温度对提取效果的影响，在此基础上结合正交试验和综合评分法进一步优化复方江鱼颗粒处方药材的提取工艺。

平行称取复方江鱼颗粒处方药材5份，每份37 g（药材配比同“2.1.2”项），分别加入6、8、10、12、14倍量（v/g）的水，在70℃条件下提取2次，每次1.5 h。依据所得槲皮素、大黄素甲醚和熊果酸的含量和浸膏得率，参考相关文献方法并结合本研究实际，采用综合评分法计算综合评分^[10]。综合评分 =（槲皮素含量/最高槲皮素含量）×30% +（大黄素甲醚含量/最高大黄素甲醚含量）× 30% +（熊果酸含量/最高熊果酸含量）×30% +（浸膏得率/最高浸膏得率）×10%。由实验结果可知（表2），溶媒用量为12倍时，综合评分最高，故确定其为较优溶媒用量。

平行称取复方江鱼颗粒处方药材5份（药材组成同“2.1.2”项），加入其质量12倍量的水，70℃提取2次，待温度恒定后开始计时，每次0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。按“2.2.1”项下方法计算综合评分。结果显示，提取时间为1.5 h时，综合评分最高（见表3），故确定其为较优提取时间。

平行称取复方江鱼颗粒处方药材5份（药材组成同“2.1.2”项），加入其质量12倍量的水，分别在50、60、70、80、90℃提取2次，待温度恒定后开始计时，每次1.5 h。按“2.2.1”项下方法计算综合评分。结果显示，提取温度为70℃时，综合评分最高（见表4），故确定其为较优提取温度。

以复方江鱼颗粒处方药材提取浸膏中槲皮素、熊果酸、大黄素甲醚的含量及浸膏得率作为指标，采用 L9（3⁴）正交试验设计表，考察溶媒用量（10、12、14倍）、提取时间（1、1.5、2 h）、提取温度（60、70、80℃）、提取次数（1、2、3次）等因素，优选出最佳的提取工艺。

依据所得槲皮素、熊果酸、大黄素甲醚的含量和浸膏得率，综合评分计算方法同“2.2.1”项。表5结果显示，各因素对综合评分的影响依次是提取次数（D）>提取温度（C）>溶媒用量（A）>提取时间（B）。由于因素B的偏差平方和最小，说明其对结果影响较小，故将其并作误差项，对其余因素进行方差分析。表6结果显示，各考察因素对综合评分无显著影响（P > 0.05）。因提取次数在该结果中影响较大，因此不选择减少提取次数以压缩整体工艺内容。并且考虑到实际应用与温度所致药材中的成分溶解速率差异，该实验中所述提取时间均为水煎液温度恒定后开始计时，确定最优提取工艺是A₂B₁C₂D₃，即采用药材质量12倍量的水，在70℃提取3次，达到提取温度后煎煮1 h。

按照水提正交实验结果制备3批样品，以指标性成分含量及浸膏得率为考察指标，对优选工艺进行验证。取处方药材共37 g，加入12倍量水（v/g），70℃条件下，提取3次，每次1 h，得提取液，药液合并过滤，4℃静置过夜，再次过滤，滤液减压浓缩得到稠浸膏，再经冷冻干燥处理，即得复方江鱼颗粒提取物干浸膏，计算浸膏得率及成分含量。结果显示，三批样品中槲皮素的含量为41.89±0.26 μg/g，熊果酸的含量为61.62±1.75 μg/g，大黄素甲醚的含量为3.07± 0.08 μg/g，浸膏得率为27.08±0.69 %。该结果表明，3批样品中各指标性成分含量及浸膏得率差异较小，说明优选的提取工艺稳定可行。

将LLC细胞以1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板中，将复方江鱼颗粒处方药材的提取物干浸膏用DMEM溶解，配制成浓度为140、120、100、80、60、40、20、10 mg/ml的药物溶液（生药量浓度）。实验同时设置空白孔、对照孔和给药孔，每组设6个复孔。空白孔不接种细胞，仅加入DMEM培养基；对照孔接种细胞并加入等体积DMEM培养基；给药孔接种细胞并加入不同浓度药物溶液。待细胞贴壁后，分别与上述溶液共孵育24 h。再于每孔中加入CCK-8溶液10 μl，避光孵育0.5 h，用酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度（OD），计算细胞存活率和药物的半数抑制浓度（IC₅₀），细胞存活率（%）=（给药孔OD值−空白孔OD值）/（对照孔OD值−空白孔OD值）×100%^[11]。结果表明（图3），复方江鱼颗粒处方药材提取物对 LLC 细胞的IC₅₀为 65.10 mg/ml。随着药物浓度升高，LLC 细胞存活率逐渐下降，提示其可呈浓度依赖性抑制 LLC 细胞增殖。

将 LLC细胞以8×10⁵个/孔的密度接种于6孔板，置于培养箱中培养24 h。吸去上清，PBS洗涤，分别加入DMEM（对照组）和复方江鱼颗粒处方药材提取物干浸膏溶液（60 mg/ml，以生药量计）处理24 h。用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞，离心后收集细胞沉淀，用预冷的PBS重悬，再次离心，加入100 μl 1×Binding Buffer 重悬细胞。各处理组细胞依次加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI 染色液，振荡混匀，室温下避光染色10 min。再加入300 μl 1×Binding Buffer混匀，用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况，并计算细胞凋亡率^[12]。结果与细胞毒性实验趋势相似（图4），与对照组相比，复方江鱼颗粒处方药材提取物处理后LLC细胞凋亡率显著升高，由（2.31±0.75）%升至（53.11±2.00）%（P<0.001），表明其可显著诱导 LLC 细胞凋亡。

复方江鱼颗粒原质量标准主要采用薄层色谱法进行定性鉴别，缺乏定量质量控制指标，难以全面反映制剂的内在质量。本研究建立了复方江鱼颗粒处方药材中槲皮素、熊果酸和大黄素甲醚的高效液相色谱含量测定方法，为完善该院内制剂的质量控制标准提供了实验依据。所选成分来源于方中主要药味，不仅因其在方中主要药味中含量较高且易于检测，更因其与该复方抗肺癌药效存在潜在关联。现代药理研究表明，鱼腥草的主要成分之一是天然类黄酮化合物槲皮素，研究表明，槲皮素可上调LC3-II/I和βclin-1的蛋白表达，通过SIRT1/AMPK信号通路激活肺癌A549和H1299细胞的凋亡及自噬^[13-14]。熊果酸又名乌索酸，是白花蛇舌草中一种具有抗氧化活性的五环三萜类化合物，可通过EGFR/JAK2/STAT3通路抑制MMP2和PD-L1表达，抑制肺癌细胞的迁移和增殖，促进细胞凋亡^[15]。大黄素甲醚是一种蒽醌类化合物，是望江南的主要成分之一，有抗癌、抗菌、抗病毒等多种作用，可通过提升ROS水平、减少脂生成等，抑制肺癌A549、H1299等细胞增殖，诱导细胞凋亡^[16-17]。因此，以这三种成分作为工艺优化的评价指标，不仅能反映提取工艺对多类活性成分的提取效率，也初步桥接了工艺优化与药效活性之间的内在联系。后续研究可进一步采用谱效关系分析，明确各成分对整体抗肺癌活性的贡献度，以建立更具专属性的质量控制体系。

复方江鱼颗粒在临床中应用多年。为保证其提取工艺的连续性和应用可行性，本研究保留原有水提工艺，并在此前工艺基础上结合单因素试验和正交试验，对溶媒用量、提取时间、提取温度和提取次数等因素进行了系统考察。考虑到该方原处方服用量较大，除指标性成分含量外，本研究同时将干浸膏得率纳入评价指标，并采用综合评分法对提取工艺进行优化，以兼顾活性成分提取效率和实际制剂应用需求^[18]。结果表明，优选得到的提取工艺稳定可行，具有较好的重复性和可操作性。与原制剂制备工艺相比，本研究优化的提取新工艺的主要活性成分提取率和浸膏得率都有一定提升。这一优化结果可在保证相同有效物质摄入量的前提下，减少患者每日服用制剂量，这不仅有助于降低生产成本，更直接回应了临床上患者反映的“服药量大”的问题，对改善患者长期用药的依从性具有积极意义。

此外，本研究初步考察了复方江鱼颗粒处方药材提取物对小鼠肺癌LLC细胞增殖和凋亡的影响。结果显示，该提取物可显著抑制LLC细胞增殖，并促进细胞凋亡，提示其具有显著的体外抗肺癌活性。结合文献报道，槲皮素、熊果酸和大黄素甲醚等成分均具有抑制肺癌细胞增殖、促进细胞凋亡的作用，因此该提取物的抗肿瘤效应可能并非来源于单一成分，而是方中黄酮类、三萜类、蒽醌类及多糖类等多种活性成分协同作用的结果。本研究目前仅完成了初步体外活性评价，其具体作用机制尚需结合凋亡相关蛋白检测及体内实验进一步阐明。