Study on the improvement mechanisms of vascular cognitive impairment from Polygonatum based on network pharmacology and molecular docking techniques

在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP）（https://www.tcmsp-e.com/）中以“黄精”为关键词搜索对应活性成分，按口服利用度（oral bioavailability, OB）≥30%且类似药性（drug-likeness, DL）≥0.18的标准筛选有效活性成分，按口服利用度（OB）≥30%且类似药性（DL）≥0.18的标准筛选有效活性成分，该标准是网络药理学中广泛采用的经验性筛选条件^[11]。OB≥30%通常表明化合物具有较好的口服吸收潜力，而DL≥0.18则基于Lipinski五规则等原理，反映化合物具有与已知药物相似的化学结构特性，从而更可能具备生物活性。

将经TCMSP筛选的候选成分以SMILES格式导入SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/），限定物种为“Homo sapiens”，选取Probability > 0的预测靶点作为该成分的潜在作用靶点。整合所有成分的预测靶点，剔除重复值，即得黄精类药小分子成分的预测靶点集

依托GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）和人类孟德尔遗传在线数据库（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM）（https://www.omim.org/）数据库，以“vascular cognitive impairment”为关键词检索与VCI相关的靶点信息。在从GeneCards数据库获取的初始靶点列表中，依据该数据库的相关度值（relevance score）进行筛选。参考同类网络药理学研究的常用标准及本数据集分数的分布情况，设定相关度值Relevance score≥5作为筛选阈值，聚焦与VCI病理过程核心关联更强的基因。将GeneCards数据筛选后的VCI靶点集与从OMIM数据库获取的靶点进行合并去除重复，得到优化的VCI疾病靶点库。利用R语言的VennDiagram包绘制韦恩图，找出黄精活性成分靶点与VCI相关靶点的交集，该交集即为黄精治疗VCI的潜在作用靶点。

整理并记录黄精所含成分与对应靶点的关联信息，利用Cytoscape3.9.1软件对构建的关联信息开展网络拓扑结构分析，并绘制“黄精-活性成分-VCI靶点-通路”网络图，直观展示各要素间相互关系。

利用相互作用基因库检索工具STRING（https://stringdb-orgs.libproxy.xmu.edu.cn:443）数据库，设定物种为“智人（homo sapiens）”，其他参数为默认值，分析靶基因编码的蛋白质间相互作用（protein-protein interaction, PPI），构建PPI网络。导出该PPI网络图并以TSV格式文件下载保存，并运用Cytoscape3.9.1对网络进行分析。

借助R语言对黄精与VCI的交集靶点数据进行基因本体论（Gene Ontology, GO）功能分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析，以校正P<0.05为筛选有统计学差异的标准，将筛选结果按Gentio rate值从小到大排序。分别选取GO分析前10个结果和KEGG分析前20个结果，绘图直观呈现。

为从黄精-VCI靶点蛋白互作网络中识别出拓扑学重要性高的核心靶点，利用Cytoscape软件（版本3.9.1）的CytoHubba插件，同时采用了最大团中心性（maximum clique centrality, MCC）、度值（degree）及介数中心性（betweenness centrality）3种算法对网络中的所有节点（靶点）进行评分与排序。设定复合标准：提取在MCC、度值、介数中心性3种算法排序中均位列前15位的靶点，取三者的交集，将这些靶点定义为本PPI网络的核心靶点。挑选前4的相关靶点和前4的化合物开展分子对接实验。从Pubchem数据库下载核心化合物三维结构sdf文件，从RCSB数据库获取关键靶点的pdb文件作为受体。在AutoDock中进行对接，统计对接分数，对接以靶点活性口袋为中心，设置网格中心坐标及尺寸为2.0×2.0×2.0 nm³，步长0.0375 nm，参数默认exhaustiveness=32。以结合能<−5.0 kcal/mol判定有效结合，结合能越低，亲和力和发生作用的可能性越大。

从GeneCards数据库初步检索到与“vascular cognitive impairment”相关的基因共10668个，通过Relevance score≥5的阈值筛选后，获得高相关度VCI靶点5 634个。从OMIM数据库补充获得VCI相关靶点4 968个。合并两个数据库并去重后，构建的优化VCI疾病靶点库共包含3 515个靶点。

通过TCMSP筛选到的黄精活性成分共12个（表1），经SwissTargetPrediction数据库搜索黄精的靶点，整理后得到352个靶点。

对黄精和VCI的靶点基因取交集，得到177个交集靶点基因（图1），这些交集靶点基因将作为黄精治疗VCI的潜在靶点用于下文分析。

在黄精-活性成分-VCI网络中，PIK3CB、PIK3CA、MAPK3、EGFR和PIK3CD等靶点连接的边线更多，与网络中其他元素关联广泛，被推测为黄精干预VC的关键靶点。同时，甘草素、黄岑素、（2R）-7-羟基-2-（ 4-羟苯基）-4-苯丙二氢呋喃及4',5-二羟基黄酮等成分在网络中的度值也较大，可能在黄精干预VCI的过程中发挥重要作用（图2）。

交集靶点编码蛋白PPI网络显示，排名前五的靶点为STAT3、SRC、EGFR、BCL2和HIF1A（图3）。

交集靶基因的GO富集结果显示，共77个生物过程（BP）、22个细胞组分（CC）和43个分子功能（MF），按P值大小列出各模块排名前10的条目（图4）。其中，BP主要涉及细胞对β-淀粉样蛋白的反应、miRNA转录的负调控、血管内皮生长因子信号通路等多种信号通路；CC主要涉及溶酶体囊泡、膜筏、突触前膜等结构；MF主要涉及雌激素2-羟化酶活性、雌激素响应元件结合、类固醇羟化酶活性等多种活性。表明黄精可能通过这些过程对VCI进行干预。

交集靶基因KEGG富集结果如图5所示，交集靶基因涉及45条通路。这些过程涵盖了多个方面的疾病和信号通路。在肿瘤相关领域，包括EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、前列腺癌、乳腺癌、胃癌等多种癌症相关情况；在代谢和内分泌方面，有内分泌耐药以及AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用；在信号传导通路方面，包含磷脂酶D信号通路、Rap1信号通路、Ras信号通路、PI3K-Akt信号通路等；在感染相关方面，涉及卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染；在致癌机制方面，有化学致癌-受体激活、化学致癌-活性氧种类。此外，还与癌症中的蛋白聚糖、癌症中的微小RNA、局灶黏附、脂质和动脉粥样硬化等过程相关，甚至和神经退行性疾病阿尔茨海默病也存在关联。提示黄精的活性成分可能通过对上述多种生物途径进行精准控制和干预来调节机体的生理功能，纠正因VCI引发的病理状态，进而发挥对VCI的治疗功效。

“药物-成分-疾病靶点图”网络中所选核心成分甘草素、黄岑素、（2R）-7-羟基-2-（ 4-羟苯基）-4-苯丙二氢呋喃、4',5-二羟基黄酮与核心靶点STAT3、SRC、EGFR、BCL2对接结合能如图6所示，结合能较低（亲和力较高）的典型组合包括甘草素-EGFR（−8.46 kcal/mol）、甘草素-BCL2（−8.08 kcal/mol）、黄岑素-BCL2（−8.41 kcal/mol）、黄岑素-SRC（−8.21 kcal/mol）如图7所示。

本研究通过构建“药物-成分-靶点”网络，揭示了黄精干预VCI的复杂作用模式。网络分析结果显示，靶点PIK3CB、PIK3CA、MAPK3（ERK1）、EGFR及PIK3CD具有较高的连接度，提示这些靶点可能是黄精干预VCI的关键节点。其中，PIK3CA和PIK3CB高连接度暗示，黄精可能通过调控PI3K/Akt信号通路，影响神经细胞存活、增殖及突触可塑性，这与VCI中常见的脑血流灌注不足、神经元损伤密切相关^[12]。MAPK3（ERK1）在网络中的核心地位提示，黄精可能通过调控该通路改善神经炎症、氧化应激及突触功能，从而缓解认知损伤^[13]。EGFR通过激活下游信号级联反应参与神经发生、血管生成及血-脑屏障修复等过程^[14]。PIK3CD更多地参与免疫调节及炎症反应^[15]，提示黄精可能通过调控该靶点抑制神经炎症级联，减轻脑损伤。文中甘草素、黄岑素、（2R）-7-羟基-2-（ 4-羟苯基）-4-苯丙二氢呋喃等成分Degree值高，是黄精发挥认知保护作用的主要活性物质基础。已有研究表明，这些成分具有抗氧化、抗炎、神经保护等多种药理学活性^[16-17]，通过与核心靶点广泛作用，协同调控多条信号通路，构成黄精多成分-多靶点-多通路的认知功能保护网络，综合改善VCI病理生理过程。需要指出的是，本研究采用的OB与DL筛选标准是网络药理学中广泛用于初筛潜在口服活性小分子的经验性条件。该标准主要适用于评估类药小分子的生物利用度。黄精中公认的重要药效成分，如多糖类及多数甾体皂苷类化合物，因其分子量、极性等理化性质差异，通常不符合此筛选条件，因而未纳入本次网络分析。因此，本研究的结果主要揭示了黄精中符合小分子药物特性的化学成分群在干预VCI中的潜在作用机制。

文中PPI结果显示，STAT3、SRC、EGFR、BCL2和HIF1A为黄精干预VCI的核心靶点，揭示了其认知保护的潜在分子枢纽。HIF1A可激活相关基因，改善脑血流灌注不足和神经元缺氧损伤^[18]。EGFR激活参与神经发生和血-脑屏障修复，提示黄精可改善神经血管单元损伤^[19]。SRC在抑制神经炎症和细胞凋亡中发挥重要作用^[20]。STAT3和BCL2分别与炎症和凋亡相关，提示黄精可调控二者平衡发挥神经保护作用^[21-22]。此外，GO与KEGG富集分析揭示了黄精干预VCI的复杂分子机制网络。GO的生物学过程提示黄精可减轻Aβ沉积毒性、调节脑血管功能；细胞组分表明，其能保护神经元结构、改善突触传递；分子功能暗示，黄精成分可调控核受体信号及神经营养因子通路。本研究KEGG通路富集结果显示， PI3K-Akt信号通路、AGE-RAGE信号通路等在黄精潜在作用网络中富集显著，提示黄精干预VCI的潜在机制可能通过多靶点调控一个与“血管损伤-神经炎症-细胞凋亡”密切相关的核心通路网络。AGE-RAGE信号通路的富集至关重要，该通路在认知功能障碍中被持续激活，可驱动氧化应激与慢性炎症，直接损伤脑血管内皮细胞及血脑屏障^[23-24]，揭示了黄精干预VCI的代谢-血管关联机制。慢性高血糖促进晚期糖基化终末产物积累，RAGE激活后通过NF-κB通路驱动神经炎症和氧化应激，同时增加BBB通透性，加速认知功能衰退^[25]。黄精作为传统消渴要药，其活性成分可能通过抑制AGE-RAGE轴激活，减轻糖尿病相关脑血管损伤，这为黄精在代谢性血管认知障碍中的应用提供了理论依据。PI3K-Akt信号通路参与细胞存活、增殖、代谢及炎症调控等多种生物学过程，其激活可抑制GSK-3β和mTOR信号，进而减轻tau蛋白过度磷酸化，改善突触可塑性功能障碍^[26]。黄精多糖能够改善阿尔茨海默病模型小鼠的认知功能并减少神经元损伤，其核心机制在于黄精多糖靶向DLAT蛋白，从而激活PI3K/AKT信号通路，并调控铜死亡相关蛋白以减轻线粒体损伤^[27]。Luo等^[7]基于网络药理学和分子对接技术分析黄精抗阿尔茨海默病机制时，同样发现PI3K-Akt信号通路为关键富集通路。然而，本研究与Luo等的研究存在本质区别，在VCI病理背景下，PI3K-Akt通路可通过磷酸化内皮型一氧化氮合酶（eNOS）促进NO生成，改善脑血管舒张功能；同时通过抑制NF-κB核转位，减轻脑微血管内皮细胞的炎症损伤^[28]。这一“血管-神经”协同保护机制是黄精干预VCI区别于AD的关键特征。杨芮等^[29]研究发现，黄精健脑颗粒干预可改善模型动物的学习记忆能力、增加脑血流量、减轻海马神经元损伤及神经炎症，其机制可能与调节PI3K/Akt/NF-κB信号通路有关。张耿超等^[30]指出，黄精多糖联合电针能显著改善大鼠的认知功能，其机制与激活PI3K/Akt信号通路、抑制下游NLRP3炎症小体，进而减轻Aβ与Tau蛋白病理沉积、抑制神经炎症与氧化应激有关。Rap1信号通路的富集是本研究的另一重要发现。Rap1作为Ras超家族小分子GTP酶，在维持血管内皮屏障完整性中发挥关键作用^[31]。Rap1A在肝窦内皮细胞中的研究提示，其通过抑制RAF1介导的Notch激活，可减轻毛细血管化和纤维化^[32]，这为理解Rap1在脑血管内皮保护中的分子机制提供了新的视角。近期研究进一步发现，黄精可通过调节肠道菌群、增强肠道屏障功能，抑制海马区NLRP3炎症小体及NF-κB信号通路的活化，从而改善模拟失重诱导的认知障碍^[33]。肿瘤与VCI在分子机制上存在显著的病理交叉。肿瘤相关通路整合了细胞周期调控、凋亡、血管生成、侵袭转移等核心生物学过程，这些过程同样参与VCI的神经元死亡、白质损伤及血管重塑。Luo等^[7]在黄精抗AD研究中发现43个基因富集于肿瘤通路，认为这反映了黄精通过调控细胞存活与死亡平衡发挥神经保护作用。本研究中肿瘤通路的富集可能具有相似的生物学意义，即黄精通过抑制病理性细胞凋亡和坏死性凋亡，促进血管生成和神经修复，从而对抗VCI中的缺血性损伤。研究结果共同提示，黄精可能通过协同调节与VCI核心病理环节直接相连的信号网络，发挥多途径改善VCI的综合效应。

分子对接结果表明，黄精核心成分甘草素、黄岑素与核心靶点EGFR、BCL2、SRC结合能低（具有较高的结合亲和力），提示黄精活性成分通过与关键靶点稳定结合发挥认知保护作用。其中，甘草素与EGFR高亲和力结合，为黄精改善VCI中脑血管损伤和神经突触丢失提供分子依据，因EGFR激活可通过下游PI3K - Akt通路促进神经元存活与突触再生^[34]。黄岑素与BCL2稳定结合可增强其对神经元的保护，原因是BCL2可抑制线粒体凋亡通路减少神经元死亡^[35]；黄岑素与SRC高亲和力结合抑制SRC介导的炎症级联反应减轻神经炎症损伤，因为SRC是炎症信号与细胞存活通路的重要枢纽^[36]。甘草素与黄岑素为黄酮类化合物，其活性基团通过氢键、疏水作用与靶点稳定结合，与抗氧化、抗炎、神经保护药理活性一致^[37-38]。该研究结果证实了网络药理学预测的药物成分与靶点相互作用的可靠性，暗示黄精可发挥多维度协同作用干预VC，如甘草素靶向EGFR促进神经修复，黄岑素协同靶向BCL2和SRC抑制神经元凋亡与炎症反应。

黄精可能通过12个活性成分作用于EGFR、PIK3CA、MAPK3等核心靶点，经AGE-RAGE信号通路、EGFR相关通路及抗凋亡通路等多途径，以“多成分-多靶点-多通路”协同方式发挥对血管性认知功能的保护作用，且核心成分-靶点组合具有高结合亲和力。研究系统性揭示了黄精在血管性认知保护方面的科学内涵，为VCI防治提供了候选成分与靶点，也为中药复杂体系机制研究提供了可推广的技术范式。但本研究依赖于数据库筛选可能存在数据偏差、分子对接为体外预测缺乏体内验证、未深入探究成分间协同作用、疾病模型局限于VCI。未来可结合体内实验验证核心机制，探索成分间相互作用，扩展至阿尔茨海默病等多认知障碍模型，并通过分子动力学模拟深入解析靶点结合模式，以推动黄精在认知功能保护中的临床转化。