Relationship between RNA-Binding Protein PUM2 and Ischemic heart disease: a bidirectional Mendelian randomization study

本研究选择与PUM2显著相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）作为工具变量（IVs），IDH作为结局变量；通过单变量双样本MR分析评估并确定PUM2与IHD之间的因果关系；随后采用异质性检验、多效性检验、MR-PRESSO等方法验证结果的可靠性，并进一步通过敏感性分析确保研究结论的可信度。具体流程如图1所示。

在开展MR分析的过程中，需严格遵循以下几项假设：其一，工具变量要与暴露因素存在强关联性（关联性假设）；其二，工具变量不得与结局存在关联（排他性假设）；其三，工具变量应独立于任何与暴露或结局紧密相关的混杂因素（独立性假设）。

从eQTLGen Consortium（https://www.eqtlgen.org/phase1.html）平台下载外周血meta分析的显著顺式eQTL数据，并检索PUM2，获得可用的PUM2顺式eQTL ^[16]。IDH的数据来FinnGen数据库（https://r12.finngen.fi/），包括500348名研究对象（其中8408名IDH患者）。IDH按照国际疾病分类第十版（ICD-10）进行诊断。PUM2顺式eQTL和IDH的研究对象均为欧洲人群，且彼此不重叠，能有效减少样本重复引起的偏差，提高研究的准确性和可靠性^[17]。

MR研究中IVs的筛选严格遵循相关性、独立性和排他性假设，具体步骤如下：SNP的初步筛选：鉴于全基因组显著性水平P≤5×10⁻⁸时，与PUM2顺式 eQTL强相关的显著SNP仅2个（数量不足），将筛选阈值调整为P<1×10⁻⁵，以获取足量候选SNP；连锁不平衡的排除：采用 r²<0.001且区域宽度10 000 kb的标准，剔除存在连锁不平衡的SNP，确保工具变量的独立性，减少等位基因非随机分布的干扰^[18]；遗传信息校准：通过等位基因频率分析指定正向等位基因，并删除回文SNP，保证遗传信息解读的一致性与准确性；弱工具变量的剔除：计算各SNP的F统计量（公式：F=R²（n−k−1）/[k（1−R²）]，其中n为暴露因素全基因组关联研究样本量，k为纳入工具变量数量，R²为SNPs解释的暴露变异比例），剔除F≤10的位点^[19]；同时通过R²值计算暴露的方差比例，验证工具变量与暴露因素的强相关性，最终确保纳入MR分析的SNP均满足F>10。经上述步骤筛选后，最终用于MR分析的SNP共4个。

观察PUM2与IDH之间是否存在双向因果关联。利用异质性、水平多效性分析进行敏感性检验，确保结果可靠稳健。

本研究借助R 4.4.1软件中的TwoSampleMR 0.6.21包与MR-PRESSO 1.0包MR分析。在分析过程中，以逆方差加权法（inverse-variance weighted, IVW）为主，同时辅以加权中位数法（weighted median estimator, WME），以此评估PUM2与IDH之间的因果关联。由于IVW法具有更高的检验效能，因此将其作为本研究的主要分析方法，研究结果的解释也以该方法所得结果为依据^[20]。

本研究采用多种统计方法对IVs的可靠性进行系统评估。采用Cochran’s Q 检验评估IVs间的异质性，以P>0.05为标准判断无显著异质性^[21]；通过 MR-Egger回归分析检测遗传变异的方向性多效性，其截距项可用于评估水平多效性，当P>0.05时提示无显著多效性影响，同时该方法可提供因果效应的一致估计^[22]；采用MR-PRESSO进一步识别水平多效性并修正潜在离群点，通过排除异常SNP以优化分析结果^[23]；采用留一法（leave-one-out），即逐一排除单个SNP后，以剩余IVs重复双样本MR分析，以此评估单个SNP对总体因果关联的影响程度^[24]。所有统计分析以P<0.05为差异具有统计学意义。

本项MR分析所采用的数据均源自已公开发表的GWAS汇总统计结果。由于在各独立研究开展过程中，相关机构的伦理审查委员会已要求所有参与者提供书面知情同意，因此本研究无需另行申请伦理审批，亦无需再获取参与者的知情同意^[25]。

本研究共筛选到4个敏感SNPs进行PUM2与IDH因果关系的分析，纳入分析的SNPs的具体信息见表1。

本研究主要采用IVW法对双样本MR结果进行分析（图2）。结果显示，PUM2与IDH存在显著的因果关联，即，PUM2水平升高与IDH风险降低相关（OR = 0.7923，95%CI：0.6627 ~ 0.9471，P = 0.0260），为保护性因素（图3）。进一步分析显示，PUM2的加权中位数法和IVW法分析结果方向一致且有统计学意义，见表2。反向MR分析结果则表明IDH对PUM2不存在反向因果关系。

本研究通过异质性检验、敏感性分析和水平基因多效性检验对结果进行敏感性分析，以确保研究结论的可靠性。异质性检验：采用Cochran’s Q检验评估纳入分析的SNPs异质性。结果显示IVW法及MR-Egger 法的Q值分别为0.0030、0.0004，P 值分别为0.9999、0.9998，说明所纳入的 SNPs 并不存在显著异质性；基因水平多效性检验：通过MR-Egger-intercept检验评估基因水平多效性，所得截距项为−0.0442（P=0.9640），表明SNPs无明显水平多效性，说明研究结果被潜在混杂因素影响的可能性较小，见表3；留一法检验：采用留一法进一步验证结果的可靠性（图4）。在MR分析中依次排除单个SNP，重复分析、考察剩余SNPs 对整体因果估计的影响，结果显示整体因果关系未发生明显变化，说明结果具有稳定性；漏斗图：通过绘制漏斗图（图5）发现纳入分析的4个SNPs基本呈对称分布，表明所得的结果较为稳定可靠。

本研究通过双样本MR分析，首次在遗传学层面证实了RNA结合蛋白 PUM2与IHD之间的因果关系。结果显示，PUM2水平升高与IHD发病风险降低显著相关（IVW法：OR = 0.7923，95% CI：0.6627 ~ 0.9471，P = 0.0260），提示 PUM2可能是IHD的保护性因素。这一发现为理解IHD的遗传调控机制提供了新视角，并为其预防和治疗靶点的开发提供了潜在方向。

RNA结合蛋白在心血管疾病中的作用日益受到关注，已有研究表明此类蛋白通过转录后调控参与血管内皮功能、炎症反应及心肌重构等机制^{[5, 6]}。PUM2作为PUF家族成员，通过与靶mRNA 3'非翻译区结合抑制翻译起始复合物形成，从而负调控细胞增殖^{[12, 13]}。在IHD发生过程中，心肌缺血/坏死可诱发成纤维细胞过度增殖，导致心脏纤维化加重^[15]。本研究结果与此相符，推测PUM2可能通过抑制成纤维细胞增殖及胶原合成（如COL1A1、COL3A1）缓解纤维化进程^{[14, 26]}。此外，PUM2在心肌细胞存活中的调控作用亦值得注意，如在缺血模型中，其表达变化可影响细胞凋亡通路^[27]，从而增强心肌耐受力，降低IHD风险。

从机制角度进一步分析，PUM2作为RNA结合蛋白，可能靶向调控下游基因，如p21等细胞周期抑制因子，通过抑制翻译过程阻碍PI3K/AKT或MAPK信号通路的激活，从而负调控细胞增殖^[28]。类似地，在动脉粥样硬化相关研究中，RNA结合蛋白GIGYF2通过上调STAU1诱导mTORC1-S6K1信号影响内皮衰老^[29]，而PUM2或通过类似机制抑制炎症因子（如TNF-α、IL-6）表达，减轻斑块形成^[30]。此外，PUM2可能维持心肌能量代谢稳态，通过调控糖酵解或脂肪酸氧化相关mRNA（如参与代谢途径的基因）缓解缺血损伤^[31]。这些机制与本研究发现一致，提示PUM2在IHD保护中的多靶点作用。在IHD方面，PUM2有可能通过类似机制，抑制这些基因或因子的表达，从而阻碍斑块的形成与发展；另外，PUM2或许能够通过调节心肌细胞内与能量代谢相关基因的mRNA，如参与糖酵解、脂肪酸氧化等过程基因的mRNA，维持心肌细胞能量代谢稳态，减轻缺血导致的心肌细胞凋亡，不过这一机制仍有待后续功能实验进一步验证。

本研究的优势在于：首先，采用MR方法，利用遗传变异作为IVs，有效降低了传统观察性研究中混杂因素和反向因果关系的干扰，增强了因果推断的科学性。其次，通过严格筛选IVs并结合Cochran's Q检验、MR-Egger回归和留一法等多种敏感性分析，全面验证了结果的稳定性，确保了研究的可靠性和可重复性。最后，本研究首次系统探讨了PUM2与IHD之间的遗传因果关联，为RNA结合蛋白在心血管疾病中的潜在作用提供了新见解。

然而，本研究也存在一些局限性：首先，研究数据主要基于欧洲人群，存在种族特异性，其结果在其他族群中的普适性需通过跨人群验证。其次，MR方法仅能揭示遗传层面的因果关系，未能深入解析PUM2在IHD发生发展中的具体分子机制，建议结合体外实验和动物模型进一步探索。第三，由于GWAS数据限制，本研究未细化分析PUM2不同表达水平对IHD亚型（如MI或不稳定型心绞痛）的差异影响。第四，未纳入环境因素或表观遗传修饰等潜在变量，可能低估了基因-环境交互作用对研究结果的影响。

综上所述，本研究通过双样本MR分析确认，PUM2水平升高与IHD发病风险降低呈显著负相关，提示其可能作为IHD的潜在保护因子。未来研究可聚焦于：一是利用分子生物学手段明确PUM2调控IHD的靶基因和信号通路；二是开展多民族队列研究以验证结果的一致性；三是探索基于PUM2的干预策略，为IHD的精准诊疗提供创新思路。