Hydrogel scaffolds loaded with bone marrow mesenchymal stem cells/resveratrol liposomes for traumatic brain injury treatment

Thermo UltiMate 3000液相色谱仪（美国Thermo公司）；冷冻干燥机V55C（美国Virtis有限公司）。FBS（美国Gibco公司）；MSCs培养基套装（上海唯恩生物有限公司）；MEM培养基（上海源培生物科技股份有限公司；RSV（99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氢化卵磷脂（艾伟拓（上海）医药科技有限公司）；胆固醇（99%生物技术级，上海麦克林生化科技股份有限公司）；NIPAM（上海泰坦科技股份有限公司）；透明质酸（生工生物工程（上海）股份有限公司）；丝素蛋白（150KD，复向丝素医疗科技（苏州）有限公司）；活性氧检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；TNF-α ELISA试剂盒（武汉菲恩生物科技有限公司）；Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

SD大鼠，C57小鼠，购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司；动物实验均经海军军医大学医学伦理委员会批准，并按照海军军医大学动物护理和使用指南进行饲养。

取SD大鼠（雄性，2～3周），麻醉后脱颈处死，分离股骨和胫骨，PBS冲洗骨髓腔并收集冲洗液，过70 μm筛网后以300×g离心5 min，以PBS重悬，300×g离心5 min，以红细胞裂解液重悬，静置10 min。 450×g离心后以PBS重悬，300×g离心5 min得到细胞沉淀。加入MSCs完全培养基，接种于细胞培养皿，置于37 ℃，5% CO₂细胞培养箱培养。

称取0.153 g NIPAM，溶解于双蒸水中，在冰浴条件下氮气除氧1 h。过硫酸钾（KPS，0.058 g）和2-巯基乙胺（AET，0.122 g）分别溶解于双蒸水中，在冰浴条件下氮气保护搅拌。4 h后，加入HA溶液（0.256 g溶解于双蒸水中），加入EDC/NHS（0.200 g; 0.100 g），N₂保护低温反应24 h，得到NIPAM-HA。

将NIPAM-HA和SF混合（SF∶HA=1∶1），加入EDC/NHS（0.400 g; 0.200 g），N₂保护低温反应24 h。透析3 d，收集产物，−80 ℃过夜，使用真空冷冻干燥机冻干3 d，得NIPAM-HA-SF。

以薄膜分散-挤出法制备RSV-LIP。称取RSV、卵磷脂、氢化卵磷脂、胆固醇适量，溶解于10 ml混合溶剂中（甲醇∶氯仿=1∶1，V/V），浓度分别为0.20、0.66、1.54、0.734 mg/ml。45 ℃，20 r/min避光旋蒸1 h，加入5 ml PBS（1×，pH 7.4），45 ℃水化1 h。而后将混悬液依次通过挤出器过400、100 nm膜各挤出30次，得到RSV-LIP。

取RSV-LIP混悬液，马尔文激光粒度仪测定粒径、Zeta电位。

色谱条件：色谱柱：Diamonsil C₁₈（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）（65:35）；流速：0.8 ml/min；检测波长：306 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μl。

取 200 μl RSV-LIP溶液，加入4倍体积甲醇涡旋15 min，4 ℃，15 000 r/min离心30 min，取上清液，HPLC法测定脂质体中药物浓度。同时取200 μl RSV-LIP，4 ℃，15 000 r/min离心30 min，吸弃上清液，加入甲醇混匀，4 ℃，15 000 r/min离心 30 min，取上清液，HPLC分析，按照以下公式测定载药量和包封率：

取适量NIPAM-HA-SF溶解于双蒸水，加入适量RSV-LIP，搅拌均匀，置于37 ℃孵育10 min即得载RSV-LIP水凝胶。

线性：色谱条件同“1.4.3”。精密量取一定体积的对照品母液于5 ml容量瓶中，分别用甲醇稀释为浓度为1、4、10、20、50、100、200 μg/ml的对照品溶液。按上述色谱条件进行测定，以RSV质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归。

专属性：精密称定RSV对照品10 mg加甲醇溶解，置于100 ml棕色容量瓶并定容至刻度线，摇匀，即为对照品溶液。取100 μl载RSV-LIP的水凝胶，甲醇溶解后置于5 ml容量瓶中并定容，超声5 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜即得供试品溶液。取100 μl空白脂质体凝胶，按供试品溶液的制备方法制备，即得阴性样品溶液。

精密度：取4、20、200 μg/ml的对照品溶液，按上述色谱条件1 d内重复进样3次考察日内精密度，同时连续3 d测定以考察日间精密度。

回收率：取100 μl载空白脂质体的水凝胶置于5 ml容量瓶中，分别加入不同体积的RSV对照品溶液，以甲醇定容至刻度线，使RSV浓度分别为4、20、200 μg/ml，同浓度制备3份。摇匀，超声5 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm滤膜后进样测定。

体外释药：取适量载RSV-LIP的水凝胶装封于透析袋（3.5×10⁶ Da）中，置于20 ml的双蒸水中，37 ℃，100 r/min条件下持续震荡。分别于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h吸取1 ml袋外溶液，并补充相同温度体积的空白释放介质。取出溶液加入适量甲醇，10 000 r/min离心15 min，取上清液，过0.22 μm滤膜后进样。测定不同时间点释放介质内RSV的浓度，绘制体外释放曲线，计算RSV的累计释放度。

将BMSCs与RSV-LIP和水凝胶一起共孵育，使用Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒检测BMSCs生存情况。取生长状态良好的BMSCs，将1$ \times $10⁵个细胞接种到共聚焦皿中，并加入灭好菌的水凝胶及RSV-LIP，置于37 ℃，5% CO₂细胞培养箱中培养。培养1、4 d后，用 Calcein AM/PI检测工作液检测。激光共聚焦显微镜观察染色效果，活细胞呈绿色荧光，死细胞呈红色荧光。

以TBHP制备神经元细胞氧化应激损伤模型。分组为对照组，TBHP组，BMSCs组，RSV组，RSV-LIP组，BMSCs-RSV-LIP组。取对数生长期的HT22细胞接种至24孔板，37 ℃孵育24 h后，每孔加入1 ml培基稀释的TBHP（10 μg/ml），37 ℃孵育24 h后吸弃上清液，按分组加入各组样品，其中RSV为10 μg/ml，BMSCs为1×10⁵个/孔，37 ℃孵育48 h。使用ROS检测试剂盒检测各组ROS水平，荧光酶标仪检测荧光强度（Ex/Em=488/525 nm）。

以LPS制备小胶质细胞炎症损伤模型。分组为对照组，LPS组，BMSCs组，RSV组，RSV-LIP组，BMSCs-RSV-LIP组。取对数生长期的BV2细胞接种至24孔板，37 ℃孵育24 h后，每孔加入0.10 μg/ml的 LPS，37 ℃孵育24 h后吸弃上清液。按分组加入各组样品，其中RSV为10 μg/ml，BMSCs为1×10⁵个/孔，37 ℃孵育24 h。取细胞上清液，收集于离心管内，使用ELISA 试剂盒检测TNF-α水平，酶标仪 450 nm检测吸光度值。

构建划痕损伤模型。分组为对照组，BMSCs组，RSV组，RSV-LIP组，BMSCs+RSV-LIP组。取对数生长期的NE-4C接种至24孔板，细胞密度达80%～90%后用1 ml枪头在细胞层上进行划痕。划痕结束后，使用PBS洗细胞1次，按分组加入各组样品，其中RSV为10 μg/ml，BMSCs为1×10⁵个/孔，置37 ℃，5% CO₂培养箱培养。0、12、24 h观察各组细胞的迁移情况并拍照。

C57小鼠（雄性，8周龄）随机分组：Sham组（假手术组）、对照组（造模后不给药）、载BMSCs水凝胶组、载RSV-LIP水凝胶组、载BMSCs/RSV-LIP水凝胶组，每组6只。

建立控制皮质冲击（controlled cortical impact，CCI）损伤模型。腹腔注射1%（w/v）戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠（50 mg/kg），固定于脑立体定位仪，沿头顶正中线做约1 cm左右的纵向切口，暴露出头骨。在前囟后约1 mm，冠状缝右侧约2 mm位置，钻出一个直径为4 mm 圆形孔。设置仪器工作参数：冲击速度为5 m/s，冲击深度为1.0 mm，冲击持续时间为100 ms，对小鼠脑部进行撞击。撞击结束后按分组进行处理，脑损伤原位注射20 μl含药凝胶（BMSCs：1×10⁶个/只，RSV：0.9 mg/kg），消毒伤口并进行缝合。

改良神经功能损害（mNSS）评分实验。根据mNSS评分标准，对各组TBI小鼠的运动、感觉、平衡能力以及反射反应等情况予以评估。mNSS评分为0～18分，分数越高表明TBI小鼠的神经功能损伤越严重。本实验于TBI术后1、2、3、4、5、6、7、9、11、14 d进行评估。

踏空实验。TBI术后1、2、3、4、5、6、7、9、11、14 d将各组TBI小鼠放置在铁丝网格随机的位置上，观察并记录其行走的总步，以及在移动过程中踩空的次数。计算踩空次数和总步数的比值，比值越大说明TBI小鼠的神经损伤越严重。

悬挂实验。水平悬空固定一根钢针，TBI术后1、2、3、4、5、6、7、9、11、14 d依次将各组TBI小鼠挂在钢针的中间，观察并记录其在钢针上悬挂的时间及状态。评分标准为：脱落（0分）；仅悬挂在钢针上（达30 s），但无法移动（1分）；前爪挂在钢针上，同时后爪试图挂钢针上（2分）；两只前爪和一只或两只后爪挂在钢针上（3分）；四只爪子都挂于钢针，且尾巴卷在钢针上（4分）；爬到了一侧固定的架子上（5分），分值越低说明TBI小鼠的神经损伤越严重。

采用GraphPad Prism 9（GraphPad Software, San Diego, CA）计算。两组间数据的比较采用Unpaired Student’s T-test，多组间的数据比较采用One-way ANOVA。以^*P<0.05表示差异有统计学意义，^**P<0.01表示差异显著，^***P<0.001表示差异非常显著。

如图1B、1C所示，BMSCs与RSV-LIP和水凝胶共培养1、4 d，激光共聚焦显微镜观察显示绿色荧光细胞较多，BMSCs生长状况良好，随着时间的延长，死细胞的比例增加，活细胞也有所增加，说明装载RSV-LIP的水凝胶支架对细胞活性无影响，具有较好的生物相容性。

RSV-LIP的粒径、Zeta电位分别为（127.80±0.41）nm，（−4.90±0.51）mV。

RSV-LIP中RSV的包封率为（78.50±1.48）%，载药量为（2.37±0.06）%。

如图2所示，方法专属性良好，RSV保留时间为5.90 min，空白载体对RSV测定无干扰。1~200 µg/ml浓度范围内，RSV浓度（C, μg/ml）与峰面积（A）呈良好线性关系，线性回归方程为 A=1.953 8C+3.012 3，r=0.9998。

由表1可知，低、中、高浓度RSV在日内和日间均具有良好的精密度，日内精密度和日间精密度RSD均小于5%，表明所建立方法的精密度满足要求，可用于样品中RSV的含量测定。

由表2可知，低、中、高浓度RSV的回收率均在95%～115%范围内，且RSD值均小于5%，表明该方法稳定可靠，可用于样品中RSV含量的测定。

载RSV-LIP的水凝胶前2 h累计释放RSV约15%，在24、48和72 h的累计释药量分别是（39.57±0.36）%、（42.23±0.13）%和（43.31±0.34）%，具有明显的缓释作用。

如图3所示，BMSCs组、RSV组、RSV-LIP组、BMSCs+RSV-LIP组ROS水平均低于TBHP组，其中，BMSCs+RSV-LIP组差异显著（P<0.001），说明BMSCs和RSV均具有抗氧化应激损伤的作用，合用具有协同增效的作用。

如图4所示 BMSCs组、RSV组、RSV-LIP组、BMSCs+RSV-LIP组的TNF-α水平均低于LPS组（P<0.001），说明BMSCs和RSV均具有抗炎作用。其中，BMSCs+RSV-LIP组、RSV-LIP组的抗炎作用显著高于RSV组（P<0.01）、BMSCs组（P<0.001），说明RSV以脂质体形式给药具有显著抗炎作用。

如图5所示，比较0、12和24 h划痕宽度，BMSCs组和BMSCs+RSV-LIP组NE-4C细胞迁移速度明显较快，表明BMSCs可以促进神经干细胞迁移，有助于损伤神经系统的再生修复。

如图6A所示，载BMSCs/RSV-LIP水凝胶组悬挂得分显著高于对照组（P<0.001），载RSV-LIP水凝胶组得分显著高于对照组（P<0.001）。如图6B所示，载BMSCs水凝胶组、载RSV-LIP水凝胶组、载RSV-LIP/BMSCs水凝胶组踏空概率均显著低于对照组（P<0.001）。如图6C所示，载BMSCs/RSV-LIP水凝胶组mNSS评分低于对照组（P<0.01），综合说明载BMSCs/RSV-LIP水凝胶可以改善TBI小鼠肢体协调能力和平衡功能，促进TBI小鼠感觉运动功能的恢复。

MSCs用于再生医学的多种机制及作用得到广泛研究，作用于中枢神经的修复中，不仅可以促进内源性神经干细胞的增殖、迁徙和分化^[19]，同时具有抗炎作用^[20]以及促进受损BBB恢复^[21]等功能。但是干细胞移植治疗还存在一些问题，受损和病变组织内的恶劣环境不利于干细胞的有效保留、存活和增殖^[22]。创造有利于干细胞局部驻留发挥活性的的微环境，成为提高干细胞移植疗效的重要举措。白藜芦醇可以抑制神经炎症和细胞凋亡，减少梗死体积和神经元损伤，改善神经功能^{[23, 24]}。白藜芦醇通过对NF-κB活化途径的抑制，抑制巨噬细胞分泌细胞因子，减轻炎症反应，还可以抑制脂质过氧化。研究发现，白藜芦醇可以剂量依赖性抑制IL-1α、IL-6和TNF-α的产生，并在体外下调IL-17的mRNA表达和蛋白质分泌^[25]。Guo等^[26]亦证实白藜芦醇可以明显抑制巨噬细胞内TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，下调了toll样受体4（TLR4）/NF-κB/缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的蛋白表达，具有显著的抗炎、抗氧化机制^[27]。但是白藜芦醇在碱性条件下稳定性降低，对光敏感易降解，水溶性差^[28]，多种递送系统如脂质体、微乳、纳米囊泡等进行了研究用以控制白藜芦醇的稳定性和释放^[29]。本研究中将白藜芦醇制备为脂质体，形成水分散系统从而有利于在水凝胶中分散，同时药物从脂质体中缓慢释放，从而持续发挥治疗作用。同时干细胞在水凝胶中的生物活性对其发挥作用很重要，我们考察了载有白藜芦醇脂质体的水凝胶中，细胞的生存状态良好，说明BMSCs可以在水凝胶中维持较好的活性。

水凝胶具有三维交联的聚合物网络，能够提高细胞移植滞留和存活率，控制药物释放速度，常被用作治疗载体实现局部或全身药物输送。本文构建了的温敏水凝胶支架，包载BMSCs和RSV-LIP发挥协同作用。研究表明，内源性的神经干细胞的再生和分化在TBI损伤的情况下受到抑制，BMSCs具有促进神经干细胞增值的作用，同时白藜芦醇具有显著的抗炎和抗ROS活性，二者联合将改善TBI损伤后微环境，促进内源性神经干细胞的迁徙和增殖。同时水凝胶可以模拟细胞外微环境，为BMSCs驻留和活性保持提供适宜环境。水凝胶的基质材料为透明质酸和丝素蛋白，均为天然的高分子材料，透明质酸是构成细胞ECM的重要组成部分，丝素蛋白具有天然的降解特性，被FDA批准用于医药辅料，因此制备的水凝胶具有良好的生物相容性，一方面赋予细胞生长驻留的空间，提供支架环境有利于细胞增殖和活性保，载体同时具有生物降解特性，安全性好适宜用于中枢给药。