Mechanism of Shen Hong capsule in preventing and treating acute mountain sickness based on network pharmacology and in vitro experiments

结合中药信息数据库和分析平台（TCMSP）、中药集成数据库（TCMID）及相关文献报道，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为筛选条件，对丹参、三七、西洋参、砂仁、檀香、藏红花、冰片、山楂8味中药进行活性成分检索。再根据得到的活性成分进行作用靶点检索，将所有的靶点蛋白名通过Uniprot数据库转化为通用基因名。通过Cytoscape软件进行数据可视化，构建“中药-活性成分-预测靶点”网络图。

通过治疗靶点数据库（TTD）、疾病相关基因和变异信息的综合平台（DisGeNET）、基因数据库（GeneCards）进行疾病靶点检索，以“high altitude pulmonary edema”、“high altitude cerebral edema”、“high altitude reaction”、“acute mountain sickness”等为检索关键词。得到疾病靶点后，剔除得分较低的靶点。通过Venny网站在线绘制文恩图，将筛选后得到的疾病靶点与参红胶囊的预测靶点取交集，交集靶点即为参红胶囊防治高原反应的潜在治疗靶点。

将得到的参红胶囊防治高原反应的潜在治疗靶点导入蛋白相互作用数据库（STRING），检索到靶点蛋白之间相互作用关系，导出数据，通过Cytoscape软件构建PPI网络图，使用CytoNCA插件进行数据拓扑分析，根据degree值对PPI网络图进行可视化分析。

将参红胶囊防治高原反应的潜在治疗靶点导入生物信息数据库（DAVID），得到生物过程富集注释（GO）及信号通路（KEGG）。将数据导出，以P值作为筛选条件，剔除P值大于0.01的生物过程及信号通路。

选取PPI中degree值排名前10的潜在靶蛋白作为关键靶点，从PDB蛋白数据库找到合适的蛋白复合晶体结构，下载pdb格式文件，导入PyMOl软件中，将复合晶体结构中原有的配体及水分子删除，只保留蛋白大分子结构，仍然保存为pdb格式。将整理所得靶点蛋白所对应的、相关性较强的活性成分作为分子对接的小分子配体，从PubChem数据库中找到活性成分2D分子结构，下载mol2格式文件，导入OpenBabel软件，将mol2格式转化为pdb格式。蛋白大分子与活性成分配体通过Autodock软件进行分子对接，对接完成后，根据键能的大小选取最佳对接构象。

取2 g参红胶囊药粉用200 ml 70%乙醇加热回流提取6 h，转移全部提取液，将提取液浓缩至近干，用甲醇溶解并定容至5 ml，溶液过0.45 μm 微孔滤膜后上机测试。实验仪器型号：赛默飞U3000+MSQ Plus；色谱柱：Xtimate UHPLC C₁₈, 1.8 μm, 2.1 mm×100 mm；柱温：55℃；流速：0.3 ml/min；进样量：10 μl；流动相：乙腈和0.1%甲酸水，梯度洗脱信息见表1。质谱条件：离子源为 ESI 源，正离子扫描，Cone 75v，Needle 3.5kv，Probe Temperature 350℃。

心肌细胞H9c2由空军特色医学中心临床医学实验中心提供；DMEM培养基（批号：GP22030160220）、青链霉素（批号：CR2201019）、胰酶（批号：CA22030013660）、制胶试剂盒（批号：P0012AC）、电泳缓冲液（批号：20211215）、转膜缓冲液（批号：20211210）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；四季青胎牛血清（批号：20201124）、CCK-8试剂盒（批号：20210323）、IDF-11774抑制剂（批号：HY-111387）购自北京拜尔迪生物技术有限公司；NOS3抗体（批号：00103575）、PPARG抗体（批号：10014314）、HMOX1抗体（批号：00100097）、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（批号：00101747）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；Hoechst 33342染色液（批号：C1026）购自上海碧云天生物技术有限公司。

根据筛选出来主要活性成分的性质，均不溶或者微溶于水、可溶于乙醇，因此选择参红胶囊药粉醇提物进行体外实验。药粉加10倍量无水乙醇超声1.5 h，滤液浓缩干燥，每1 g醇提物加1 ml乙醇溶解后，加完全培养基（90% DMEM + 10% FBS）稀释，终浓度调整为每1 ml药液含有1 mg醇提物，分装后储存于−20℃。通过LC-MS对醇提物中关键活性成分进行鉴定，取1 ml浓度为1 mg/ml的药液用甲醇溶解并定容至5 ml，溶液过0.45 μm 微孔滤膜上机测试。检测条件同1.6。

H9c2心肌细胞需要90% DMEM + 10% FBS培养基，于37℃、5% CO₂恒温培养箱中生长。分组：正常组、模型组、参红胶囊组（SH）、IDF-11774抑制剂组。体外细胞缺氧模型建立：将对数生长期的细胞放入缺氧盒中，12 h后，转入37℃、5% CO₂恒温培养箱继续培养6 h，模拟高原急性缺氧^[11,12]。IDF-11774为缺氧诱导因子抑制剂，可在低氧环境下抑制缺氧诱导因子HIF-1α的积累。

对数生长期的H9c2细胞经消化后加入培养基制成细胞悬液，进行细胞计数，调整细胞浓度至1×10⁵ 个/ml，接种于96孔板，每孔100 μl，放入37℃、5% CO₂恒温培养箱中稳定4 h，待细胞完全贴壁后，将孔内培养基倒掉，于吸水纸上轻拍，补充培养基，分别加入参红胶囊醇提取物和IDF-11774抑制剂，参红胶囊醇提取物终浓度为1000、750、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 μg/ml，IDF-11774抑制剂终浓度依次为20、15、10、7.5、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 μmol/L。药物处理24 h后，弃板中培养基，加入配好的CCK-8溶液（每100 μl含10 μl CCK-8），37℃孵育2 h，酶标仪检测450 nm波长处吸光度。

收集对数生长期的H9c2细胞，调整细胞浓度为1×10⁵ 个/ml，每孔2 ml，接种于6孔板，放入37℃、5%CO₂恒温培养箱中稳定4 h，按1.7.2分组，各组加入不同的药物处理24 h，除正常组外，其他各组按1.7.2方法模拟高原急性缺氧。取出6孔板，弃上层液，加4% 多聚甲醛进行细胞固定10 min，PBS洗涤3次，每次1 min，每孔加入1 ml Hoechst 33342染液，室温反应30 min，弃染液，PBS洗涤3次，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。

按1.7.4分组细胞并处理，收集各组细胞加入细胞裂解液，冰浴1 h，每15 min涡旋一次，充分裂解，离心取上清即得到所需蛋白，通过BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。以50 μg为每组总蛋白量计算上样体积。SDS-PAGE凝胶电泳，冰浴转膜，蛋白条带5% 脱脂奶粉封闭2 h，加入对应一抗4℃过夜，洗掉残留一抗，37℃ 孵育HRP标记的二抗2 h，TBST洗掉残余二抗，滴加ECL发光液，凝胶成像仪显影。

通过TCMSP、TCMID数据库及相关文献^[13-22]检索并筛选后得到91个活性成分，其中丹参61个，三七8个，藏红花5个，檀香3个，砂仁9个，西洋参9个，冰片3个，山楂2个，有2个活性成分存在于3味中药，有5个活性成分存在于2味中药，同时检索到150个成分靶点。通过Cytoscape构建“中药-活性成分-预测靶点”网络图，如图1所示。

TTD、DisGeNET、GeneCards数据库检索到515个高原反应相关疾病靶点，TCMSP数据库检索到150个参红胶囊成分预测靶点，通过Venny分析平台取二者交集靶点，即为参红胶囊防治高原反应的潜在治疗靶点。如图2所示交集靶点文恩图。

将潜在治疗靶点导入STRING分析平台，得到各靶点蛋白之间相互作用关系，将数据导出，通过Cytoscape进行可视化，如图3所示。经拓扑分析，根据degree值大小，排前10的靶点分别为TNF（26.0）、IL1B（22.0）、VEGFA（22.0）、NOS3（20.0）、EGFR（19.0）、ESR1（18.0）、PPARG（17.0）、NR3C1（14.0）、HMOX1（14.0）、IFNG（14.0），作为核心靶点，用于之后的分子对接。

将潜在治疗靶点导入DAVID数据分析平台，GO功能注释得到163个生物过程目录，KEGG富集分析得到44个信号通路目录。以P值<0.01为筛选条件，生物过程主要涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、对缺氧的反应、氧化还原过程、血管舒张的正调节、一氧化氮生物合成过程的正调控、血压调节、序列特异性DNA结合转录因子活性的正调控、细胞对脂多糖的反应、血管生成的正向调节、细胞增殖等；信号通路主要富集于HIF-1信号通路、癌症的途径、雌激素信号通路、破骨细胞分化、PPAR信号通路、药物代谢-细胞色素P450、细胞色素P450对外源性物质的代谢等信号通路，其中与目标疾病相关性较强的通路有HIF-1信号通路、药物代谢-细胞色素P450、细胞色素P450对外源性物质的代谢等。GO功能注释生物过程如图4所示，KEGG信号通路富集分析如图5所示。

根据信号通路上富集的靶点蛋白，找寻其对应的活性成分，选取槲皮素、木犀草素、山奈酚3个活性成分，作为分子对接中的小分子配体。由PPI网络图筛选出的10个核心靶点TNF、IL1B、VEGFA、NOS3、EGFR、ESR1、PPARG、NR3C1、HMOX1、IFNG，作为分子对接中的蛋白大分子受体，从PDB蛋白数据库中寻找到合适的蛋白晶体结构。将活性成分与相对应的靶点蛋白进行分子对接，分子间键能越大，代表活性成分在该靶点的潜在作用越强。参红胶囊主要活性成分与核心靶点分子对接结果（图6）可以看出，对接构象稳定、活性成分与靶蛋白形成稳定氢键、匹配度良好、结合活性良好。

通过LC-MS鉴定网络药理学筛选出的参红胶囊3个主要活性成分，包括槲皮素、木犀草素、山奈酚。如图7所示，参红胶囊药粉及醇提物中槲皮素、木犀草素和山奈酚的出峰保留时间分别为是6.940min、6.975min和7.305min，与对应标准品的出峰保留时间相同。

药物最适浓度的筛选，参红胶囊组IC₅₀为888.5 μg/ml，当浓度为62.5 μg/ml时不影响细胞增殖，见图8A；IDF-11774组IC₅₀为12.41 μmol/L，选择1.25 μmol/L为细胞最适浓度，见图8B。

各组细胞经处理后，通过Hoechst 33342染液观察细胞凋亡情况。如图9所示，正常组细胞核呈均匀状，淡蓝色荧光；模型组细胞不规则、细胞核皱缩，显亮蓝色荧光；参红胶囊组和IDF-11774组细胞形态趋近于正常组。

通过 Western blotting检测处理后细胞蛋白表达水平的变化。如图10所示，缺氧诱导因子HIF-1α在模型组中处于高表达水平，参红胶囊组和IDF-11774组低于模型组并趋近于正常组；预测靶点PPARG、NOS3、TNF在模型组中呈低表达水平，参红胶囊组和IDF-11774组高于模型组趋近于正常组的表达水平。

中医理论认为，在高原低氧环境影响下，人体正气虚损，气虚不运化水谷之精微，机体组织无精气营养而造成的病态反应，故辩证施治多采用扶正补气、活血化瘀、益肺健脾及补益肝肾的药物进行配伍和组方来提高机体的抗缺氧能力。出自《时方歌括》的经典方剂丹参饮，由丹参、檀香、砂仁组成，主治心痛、胃脘诸痛^[23]。参红胶囊在丹参饮的基础上进行加味，经多年的临床使用，不断改进，在实践中总结而得的可行方。前期，通过小鼠密闭缺氧实验发现参红胶囊能够剂量依赖性地显著提高抗缺氧能力^[24]，但具体的作用机制目前还不明确。因此，本研究基于生物信息学平台，通过网络药理学的方法对参红胶囊防治高原反应的作用机制进行探讨并通过体外细胞实验进行初步验证。检索并筛选得到，参红胶囊8味中药的91个活性成分、150个药物作用靶点，515个高原反应相关疾病靶点，Venn分析得到37个潜在治疗靶点，GO和KEGG富集分析找到163个生物过程条目及44条信号通路，充分体现了参红胶囊通过多成分、多靶点、多途径来防治高原反应。GO生物过程及KEGG信号通路分析可知，参红胶囊可能通过HIF-1信号通路及细胞色素P450相关信号通路，作用于IL1B、VEGFA、EGFR、HMOX1、NOS3、PPARG、TNF等靶点，从而调节机体缺氧反应及氧化还原过程，提高机体耐缺氧能力，调控血压、血管生成及细胞增殖，降低高原性高血压、高原性低血压、高原性细胞增多症等的发生率。分子对接结果显示NOS3-山奈酚、PPARG-木犀草素、TNF-山奈酚的对接键能较高，对接构象稳定、活性成分与靶蛋白形成稳定氢键、匹配度良好、结合活性良好。一氧化氮合成酶（NOS3）参与精氨酸和脯氨酸代谢，并催化生成一氧化氮（NO），NO是一种内皮松弛因子，具有舒张血管、调节血流、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制血小板和白细胞粘附等重要功能，可以预防在低压低氧环境中，机体血压、血流突增的病理状态^[25]；过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）参与机体代谢过程，维持机体生理功能正常运转^[26,27]；肿瘤坏死因子（TNF）除了可杀死或者抑制肿瘤细胞外，还参与调控免疫系统、炎症因子表达等，对低氧环境下脑组织、肺组织的炎症反应有重要意义^[28-30]。提示NOS3、PPARG、TNF等靶蛋白可能成为参红胶囊防治高原反应的核心治疗靶点。为验证生物信息学预测结果，进行了体外细胞实验。在之后的实验中，H9c2细胞经缺氧、复氧处理模拟高原急性缺氧建立体外模型，经药物处理后，可以减少由于缺氧造成的细胞凋亡；参红胶囊组与缺氧诱导因子抑制剂IDF-11774组同样都可使缺氧诱导因子HIF-1α的表达水平降低，缓解缺氧环境中HIF-1α高表达所造成的损伤；对预测靶蛋白检测后发现，模型组中NOS3、PPARG、TNF等可参与机体代谢、缓解低氧环境中机体炎症损伤的靶蛋白表达降低，药物处理后可逆转上述蛋白的表达。

综上所述，本研究通过网络药理学及分子对接技术，建立了参红胶囊防治高原反应的作用机制探究网络体系，初步阐述了参红胶囊基于HIF-1信号通路及细胞色素P450相关信号通路等途径，调节机体抗缺氧能力，从而起到防治高原反应的作用机制，充分体现了中药复方多成分、多靶点、多途径的整体治疗理念。同时选取了部分关键靶蛋白及信号通路进行了实验验证，结果同样印证了预测结果。本研究为深入探讨参红胶囊作用机制提供方向，也为其进一步开发及临床应用提供理论基础。