Advances in lactic acid bacteria as recombinant protein drug delivery carrier

乳酸菌作为非致病性G⁺菌，通常被认为对人体健康是安全的。不同于大肠杆菌表达系统，乳酸菌作为工程菌用于外源蛋白表达的过程中不会产生内毒素，避免了对机体造成损伤的可能^[9]。同时，通过口服等途径摄入乳酸菌来进行蛋白药物递送，无需经过复杂的产物分离纯化步骤，定植存活于肠道中的乳酸菌可以持续进行表达，在人体中发挥特定功效。与传统生物药物需注射给药途径相比，乳酸菌载药系统给药途径便捷，给药频次减少，机体依从性相对较好，因此，食品级乳酸菌成为绝佳的生物药物递送载体。作为人体天然的肠道宿主菌，部分乳酸菌能够定植于肠道，直接和肠黏膜接触，利用基因工程技术使重组乳酸菌表达外源蛋白，改造后的乳酸菌可利用其黏膜附着与递送特性，将蛋白药物直接递送至机体黏膜部位并促进吸收。基于此策略开发的重组蛋白，在黏膜免疫和黏膜药物递送领域具有应用潜力。人体黏膜给药面积大(约400 m²)，涵盖了胃肠道、呼吸道和泌尿生殖系统，黏膜药物递送载体通过口腔、鼻腔、阴道等途径比注射给药途径更加方便^[10]。

为寻求更加安全、有效、易于管理的工程菌，转基因微生物的深入研究阐明了乳酸菌的遗传和分子性状，部分乳酸乳球菌和乳酸杆菌因其固有的佐剂和免疫调节能力而被开发应用；另外一些乳杆菌属因其具有抵抗低pH的能力，并可附着于肠道上皮细胞而被用于口服疫苗的开发^[11]。乳酸乳球菌作为乳酸菌中的一种，具备生长速度快、易于操作、自身抗原性弱、不引起机体强烈免疫应答的特点，被认为是非侵入性和非致病性的种属。同时，由于其自身分泌蛋白和胞外蛋白酶产生较少，极大程度降低了对外源蛋白的干扰程度，保留外源蛋白的完整性和功能性，在多种疾病模型中作为功能性蛋白递送载体具有显著优势^[12]。其中，菌株MG1363已经完成了基因组的测序工作，证明乳酸乳球菌作为乳酸菌中最具特征性的菌种，同大肠杆菌和枯草芽孢杆菌一样可以成为分泌外源蛋白的最佳工程菌^[13]。基于这些特点，乳酸菌受到全球研究者的高度关注，其自身的安全性和低风险性更易于在疾病的治疗中被接受，有望成为一种有前途的细胞工厂。

由于机体胃肠道的恶劣环境，重组乳酸菌作为活载体所递送的肽类及蛋白类药物往往不能发挥显著的生物学功效，很难在疾病治疗中发挥作用。该问题的主要原因在于乳酸菌经过胃肠道后存活率显著下降，药物表达量不足。多种因素限制乳酸菌的存活，包括胃部的低pH环境、各类消化酶以及胆汁盐等^[14]。一项研究乳酸菌在人体胃肠道的药物代谢动力学实验表明，分别口服给予植物乳杆菌NCIMB8826、发酵乳杆菌KLD和乳酸乳球菌MG1363，4 h后收集回肠液分析，发现回肠中活菌的存活率分别为7%、0.5%和1.0%，连续口服7 d后，植物乳杆菌NCIMB8826的存活率为（25±29）%，没有菌株在体内定植^[15]。通过体内和体外模拟胃转运过程测试乳球菌N7的存活率，发现在体外模拟的胃肠道环境（含有0.5%胆汁盐、pH值为2.5的GM17琼脂板中）时，N7菌株只显示出中等的存活率；经口灌胃小鼠后，活菌只能在24~48 h的粪便中被监测到，只有通过每天给药的方式才能保证活菌株N7持续存在于肠道中，这一研究表明胃肠道环境可能会严重降低乳酸乳球菌的活性^[16]。另外，水凝胶、微球、脂质体、纳米颗粒等传统的蛋白药物口服递送系统，很难抵抗胃肠道环境，极易导致蛋白质变性和降解，较难用于乳酸菌的保护^[17]。开发能有效提升乳酸菌胃肠道存活率的新型保护策略，已成为推动其临床应用的关键。

乳酸菌通常必须在胃部的酸性环境中存活下来，并以活菌状态到达小肠定植才能发挥治疗功效。通过现有的技术筛选获得能够抵抗胃肠道系统的菌株作为蛋白药物递送载体，可以有效减少给药频次和剂量，从而达到提高治疗效果的目的，这成为开发乳酸菌应用的一个方向。一方面，基于qPCR技术通过对16S rRNA的研究，已经证实部分乳酸菌可以在人体特定部位有效定植。迄今为止，消化道内已检测到超过20种乳酸菌，口腔和阴道中乳酸菌的比例最高，表明从这些开放环境中分离乳酸菌通常比从胃肠道更容易。从人体或动物的肠道中分离获得的乳酸菌与其他种属的乳酸菌相比有着更强的黏附能力，如B.longum和Bcateroides thetaiotaiotaomicron^[18]。另一方面，设计合适的益生菌制剂用于延长保存期限、保持益生菌进入体内后的活力、抵抗胃液环境。利用藻酸盐喷雾干燥包封活益生菌，是一项极具商业化潜力的技术。该工艺将益生菌制成干燥细粉，其在冷藏8周后仍能保持活性稳定。藻酸盐包被层能在酸性环境下为益生菌提供物理隔离与局部pH缓冲的双重保护，这为益生菌在食品和医药领域的应用提供了可行的解决方案^[19]。采用藻酸盐和甘露醇共封装产叶酸的乳酸乳球菌，胶囊化的乳酸菌与普通乳酸菌相比，在模拟胃液和肠液的环境中存活率得到明显提升，其叶酸产量与游离菌相当，混合包埋方法为乳酸乳球菌提供了很好的保护作用^[20]。此类包封包埋方法对于许多pH敏感的乳酸菌有着很好的保护效果，提供了一种提高乳酸菌胃肠道存活能力的方法。

乳酸菌作为基因工程中常见宿主菌，重组蛋白的表达多利用质粒载体工具来实现，依赖于外源基因克隆至表达载体并转导进入乳酸菌中。根据功能性外源蛋白表达的目的，一般包括3种表达策略：细胞质表达（cytoplasmic expression, CE）、细胞表面展示（surface display, SD）和细胞外分泌（extracellular secretion, ES）。不同的表达策略使乳酸菌可以在机体特定环境中发挥对应功效，用于黏膜免疫或治疗性药物的开发^[21]。最早被开发出来的pWV01和pSH71质粒复制系统，具有宿主范围广、生物兼容度高的特点，目前基于这些质粒已经衍生出了多种功能性质粒^[22]。质粒上克隆的基因DNA片段通常不含有本身的信号肽，选择乳酸乳球菌大量分泌蛋白LcoB的信号肽（Usp45或称为SP_LcoB），信号肽的引入使得乳酸菌具备高效分泌异源蛋白的功能^[23]。根据启动子的不同，乳酸菌表达异源蛋白分为组成型表达和诱导型表达^[24]。组成型表达通常无需诱导剂即可完成高产异源蛋白的目的，启动子一方面发挥控制表达开关的作用，另一方面其强度也会影响蛋白的表达量。虽然采用组成型启动子能够直接启动目的蛋白表达，但是蛋白在胞内的持续累积会导致其在胞质中发生降解，甚至对宿主菌产生毒性。在用于药物递送系统时，组成型表达不受外界因素调控，因此其在机体内部高强度持续表达也可能存在安全问题。采用诱导型表达系统可以避免蛋白过量表达对宿主本身及机体的毒副作用，同时也能在特定条件下诱导蛋白的表达。多种类型的诱导型启动子构成了不同的诱导表达系统，通过添加诱导物、抑制物或改变培养条件的环境因素（如pH值、温度或离子浓度等）来控制外源蛋白的表达。诱导型表达系统中有常见的乳链菌肽诱导表达（nisin controlled gene expression, NICE）系统，乳链菌肽激活启动子PnisA控制基因的表达，主要是由乳链菌肽激活膜定位传感器蛋白NisK后，使其磷酸化以激活胞质反应调节剂NisR，进而激活启动子控制转录，诱导水平与添加乳链菌肽的量呈正相关^[25]。P_Zn-ZitR表达系统和更加强效的Zirex调控表达系统，可以通过无毒的Zn²⁺来进行严格的蛋白表达调控，在乳酸乳球菌中引入了链球菌启动子P_czcD及其调节蛋白SczA的编码基因，与PnisA启动子耦合形成了双启动子控制下独立调节不同基因表达的系统^[26]。应力诱导可控表达（stress-inducible controlled expression, SICE）系统，基于乳酸菌groESL操纵子无需添加外源诱导物，在热休克（42 ℃）、高盐（NaCl 2.5%）、低pH（4.5）或胆汁盐（15 ng/ml）暴露条件下可表达蛋白，SICE系统在两种小鼠模型中分别成功表达了IL-10和HPV-16 E7抗原，证明了这种受应力调控的乳酸菌蛋白表达系统具有广阔的临床应用前景^[27]。

合成生物学方法已经使得传统乳酸菌通过基因改造技术展现出多种功能，结合基因编辑技术与新颖的设计理念，重组乳酸菌在疾病治疗领域展现出强大的应用价值。工程化乳酸菌的出现也成为了细胞介导生物疗法的一部分，在多种疾病领域中成为一种全新的治疗手段。重组乳酸菌在进入机体后利用与黏膜系统的相互作用，可以递送各种细胞因子、酶、抗体等，与传统的药物递送系统相比，这种可受调控的生物递送系统更加安全可靠。通过模拟蛋白类生物活性物质给药的方式，重组乳酸乳球菌NZ9000携带肿瘤抑制肽KiSS1的基因，KiSS1肽作为一种肿瘤细胞的抑制因子，该工程菌能够成功表达并分泌具有生物活性的KiSS1肽，从而显著抑制肿瘤细胞生长^[28]。治疗性多肽药物的成功表达使重组乳酸菌有了广阔的应用前景。在糖尿病治疗领域，多种生物活性肽能够发挥显著的降血糖作用，将胰高血糖素样蛋白-1受体激动剂Exendin-4的基因构建到PNZ8048载体并导入乳酸菌，异源表达重组Exendin-4的乳酸菌在体外显著增强了胰岛细胞的胰岛素分泌功能，促进了胰岛细胞的增殖，并以葡萄糖依赖性的方式刺激胰岛素分泌，同时激活了相关的信号通路，证实了这种异源表达的多肽同样具有生物活性^[29]。研究已证实，机体内的肠道与阴道菌群能通过黏膜免疫，对多种疾病发挥长期免疫保护作用，乳酸菌作为菌群中常见的一类微生物，利用这一特性在乳酸菌表面锚定抗原制备活菌疫苗，已成为一种更为安全和高效的策略^[30]。相较于传统的减毒活疫苗，乳酸菌的非致病性和非侵入性更适合被设计成为新一代黏膜活疫苗。在全球范围，许多研究都在致力于开发这一新型的黏膜活疫苗，针对HPV 16、E2、E6、E7等抗原的多种重组乳酸菌黏膜疫苗均已进入临床前和临床试验^[31]。口服、滴鼻、阴道等多种途径的给药方式让乳酸菌疫苗在不同疾病治疗中有了更多的应用，与传统的抗原表达系统相比，操作简单、应用安全、成本低廉^[32]。

重组乳酸菌在疾病治疗领域已经得到了广泛的研究应用，作为减毒病原菌运载工具的有力替代品，基因工程工具的开发也推动了乳酸菌药物递送系统的长足发展。现阶段大多数研究还受限于体外或动物模型来评估重组乳酸菌的功能，尚缺乏临床的试验论证。另外，乳酸菌作为一种活体微生物，在未来的临床应用中应更多关注于其生物安全性，包括抗生素耐药性、免疫不良反应、遗传稳定性等问题，这就对菌种及生物技术手段的选择提出了更高的要求，活载体乳酸菌的安全性成为不可忽视的环节。口服、黏膜、皮下多种给药途径决定了乳酸菌设计的不同策略，提高菌种应用效率、确定接种最佳剂量、优化菌种选择、设计表达系统等问题也是未来重组乳酸菌研究的关键。