Preliminary pre-prescription study of Tetrodotoxin

LC-2030C高效液相色谱仪（日本岛津制作所）；AL-104电子天平（METTLER TOLEDO，瑞士）；数显pH计（sartorius，德国）；紫外可见分光光度计（安捷伦科技（中国）有限公司）；循环水式真空泵（上海豫康科教仪器设备有限公司）；SECURA125-1CN型十万分之一电子天平（赛多利斯，德国）；Arium@ mini 超纯水机（赛多利斯，德国）。

河豚毒素原料药（中洋生物科技江苏有限公司，批号：20220089，含量88%）；河豚毒素对照品（泰州康特生物工程有限公司，批号：201206，含量≥99%）；磷酸、98%甲酸、柠檬酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钠、庚烷磺酸钠、磷酸二氢铵、乙酸铵、盐酸、30% H₂O₂和冰醋酸均为分析纯试剂（国药集团化学试剂有限公司）。

色谱柱为Shim-pack GISI C18-AQ（4.6×250 mm，5 μm）；流动相为5 mmol/L庚烷磺酸钠-25 mmol/L磷酸二氢铵，等度洗脱；进样量为10 μl；柱温：25 ℃；流速1 ml/min；检测波长为196 nm；检测时长为40 min。

取TTX对照品适量，精密称定，用0.1%磷酸溶液溶解并稀释制成浓度为1.0 mg/ml的TTX对照品储备液。

取TTX原料药适量，精密称定，用0.1%磷酸溶液溶解并稀释制成浓度为1.0 mg/ml的供试品储备液。

按照《中国药典》（2020版）四部通则8004缓冲液配制方法，配制pH值分别为3.5、4.5、5.0、6.5、7.0、7.4、8.0的缓冲液^[10]。称取研成细粉的TTX原料药各2 mg，分别置于4 ml不同pH值的缓冲液（25±2 ℃）中，30 min内每隔5 min强力振摇30 s，观察溶解情况，如无目视可见颗粒，视为完全溶解。如完全溶解则继续加入研成细粉的TTX原料药，同法操作直至饱和，取适量经滤膜滤过，作为溶解度试验测试溶液。

取研成细粉的TTX原料药约1 mg，置于10 ml容量瓶中，分别用0.1 mol/L盐酸和0.1 mol/L氢氧化钠溶液溶解并定容，置于70 ℃下反应20 min。精密量取各反应溶液适量，冷却至室温，分别加入对应体积的0.1 mol/L氢氧化钠或0.1 mol/L盐酸进行中和并终止反应。取适量样品经滤膜过滤后作为强酸与强碱破坏试验测试溶液。

取研成细粉的TTX原料药约1 mg，置于10 ml容量瓶中，加入30% H₂O₂溶液溶解定容后，室温反应10 min。精密量取反应溶液适量，经滤膜过滤，作为氧化破坏试验测试溶液。

取研成细粉的TTX各适量，精密称定，分别用PBS缓冲液（pH值=7.4）、0.1%甲酸溶液、0.1%柠檬酸溶液溶解，并稀释制成浓度为0.1 mg/ml的TTX溶液，然后分别置于4 ℃、25 ℃、37 ℃中储存，在第1、2、3、5、7、14、21、28 d各取适量经滤膜过滤，作为温度适应性测试溶液。

分别将对照品储备液及供试品储备液用0.1%磷酸溶液稀释至0.1 mg/ml，作为对照品溶液和供试品溶液，按“2.1”项进行测试。如图2所示，TTX的保留时间为22.665 min。理论板数为14 501，供试品溶液中主峰与邻峰的分离度为6.4。结果表明，此色谱条件可以满足TTX相关测试要求。

取对照品储备液，用0.1%磷酸溶液配制浓度为4、10、20、40、80 μg/ml的TTX对照品测试溶液，按“2.1”项进行测试。以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=12 601.2X–2 263.69（r=0.999 9）。结果表明，TTX的浓度与峰面积在测试范围内呈良好线性关系。

取对照品储备液，用0.1%磷酸溶液分别稀释至10、20、40 μg/ml的溶液各3份，按“2.1”项进行测试，计算其含量的平均值为101.000%，RSD为0.60%，表明该方法准确度良好，满足测试要求。

取供试品溶液，按“2.1”项重复测试6次，计算得到的RSD为0.17%，表明该方法重复性良好。室温分别放置0、2、4、6、8、10、12、24、48 h后按“2.1”进行测试。计算得到的RSD为1.48%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

由表1结果可看出，TTX几乎不溶于碱性水溶液，但溶解度随着pH值降低而逐渐增大，易溶于pH值为3.5的酸性水溶液。

实验结果表明，强碱对TTX的破坏能力最强，在0.1mol/L氢氧化钠溶液中、70 ℃条件下反应20 min后，TTX被完全降解。强酸对TTX的破坏能力次之，TTX在70 ℃、0.1mol/L HCl溶液中反应20 min后的降解率为60.78%；氧化对TTX的破坏能力相对最弱，在30% H₂O₂溶液中反应20 min后的降解率为17.06%。

不同介质、不同温度条件下TTX稳定性试验结果见图3。当溶剂为pH值=7.4的PBS溶液时，不同温度下TTX均表现出降解趋势，在25 ℃与37 ℃条件下保存28 d的TTX溶液降解率均超过50%，在37 ℃时PBS溶液中的TTX降解率更高达88.07±0.27%，提示在后续剂型研究中，需注意TTX在体外释放液中的稳定性。以0.1%甲酸溶液或0.1%柠檬酸溶液为溶剂的TTX溶液则较为稳定，在25 ℃和37 ℃下保存28 d含量均未表现出显著性变化。

TTX作为一种具有广泛应用前景的潜在镇痛药物，其在药理和作用机制方面的相关研究已有较多报道^[11-13]，但对于其理化性质和成药性研究的报道极少。本研究建立了高效液相反相离子对色谱法，测定TTX在不同溶剂中的溶解性，并考察温度、溶剂pH值和氧化剂对其稳定性的影响。实验结果表明TTX在酸性条件下具有较高的溶解度，前期试验还表明TTX不溶于乙醇，二氯甲烷等有机溶剂。稳定性试验结果显示TTX在强碱溶液中较不稳定，实验条件下20 min即被强碱全部降解，而在酸性条件、氧化环境中较为稳定。不同温度稳定性试验结果同样显示，TTX在0.1%甲酸或柠檬酸溶液中4周内稳定性均良好；而在pH值=7.4 PBS中降解较为迅速，即使在4 ℃条件下，pH值=7.4 PBS中28 d的降解率仍然接近50%，37 ℃条件下28 d降解率接近90%。研究结果可为TTX处方设计及制备工艺提供实验依据，并提示研究者在开展TTX剂型研究和体外释放研究时应重点关注其稳定性和降解情况。