Research progress on drug resistance mechanism of Candida glabrata

针对念珠菌属使用最广泛的药物当属唑类抗真菌药物。唑类药物通过作用14ɑ-去甲基化酶系统中的细胞色素P450，使环上氮原子与P450的血红素铁结合，阻碍麦角甾醇生物合成，同时致使其合成前体24-甲烯二氢羊毛甾醇累积，从而使念珠菌细胞膜损伤。麦角甾醇是保证念珠菌细胞膜稳定和流动性的重要成分，而ERG11编码的羊毛甾醇14ɑ-去甲基化酶作为关键酶，催化羊毛甾醇生成麦角甾醇。唑类药物通过结合14ɑ-去甲基化酶，阻碍催化过程，而麦角甾醇不足最终导致细胞膜结构改变，念珠菌增殖减少。

ERG11基因突变导致唑类药物作用靶酶羊毛甾醇14ɑ-去甲基化酶的结构发生变化，其与唑类药物的结合位点消失，无法结合，从而产生耐药性。Hull等^[6]在临床耐药分离株中发现ERG11基因G315D突变位点，这导致菌株对唑类药物敏感性降低。Zhang等^[7]在念珠菌血流分离株中发现6株光滑念珠菌耐药株，并在其中2株中检测到ERG11基因I166S突变位点，其他4株耐药株并未出现ERG11基因的突变，但仍能产生耐药。由此推测，ERG11基因突变或许不能作为光滑念珠菌耐药的主要原因。

ERG11基因高表达导致唑类药物的靶酶生成增加，药物无法完全抑制靶酶活性。Upc2A和Rpn4是光滑念珠菌ERG11表达的关键调节因子，RPN4与UPC2A的基因突变是ERG11高表达的主要原因^[8-9]。Wang等^[10]研究2株耐药分离株，其中1株的CDR1和ERG11高表达，而另1株只有CDR1高表达，尽管验证ERG11高表达确实会导致光滑念珠菌产生耐药，但由于耐药株均存在CDR1高表达，因而ERG11高表达不能作为光滑念珠菌耐药的唯一原因。

当麦角甾醇生物合成在缺氧或由于甾醇合成缺陷而受到抑制时，甾醇流入转运蛋白基因（AUS1和TIR3）和麦角甾醇生物合成通路中相关基因（ERG2、ERG3、ERG6等）在真菌细胞中表达明显上调。在低氧条件或唑类作用下，细胞中的AUS1表达增加，通过输入外源性胆固醇和麦角甾醇，可使光滑念珠菌得以存活^[11]。

与其他念珠菌不同，光滑念珠菌细胞膜上与耐药性相关的外排泵主要是ABC转运蛋白家族（由念珠菌耐药性CDR1、CDR2、SNQ2基因编码），这类外排泵通过水解ATP获得能量，并通过细胞膜主动外排药物。

CDR1、CDR2及SNQ2基因高表达导致光滑念珠菌内药物被快速排出，从而对唑类药物产生耐药性。Zhang等^[6]在念珠菌血流分离株中发现，光滑念珠菌耐药分离株的CDR1、CDR2基因表达显著增加。Wang等^[10]研究两株耐药分离株，发现CDR1基因均高表达。有研究发现^[12]，CDR1、CDR2在16种耐药分离株中分别有12及8株高表达，且其中有4株耐药株CDR1、CDR2同时高表达；而有8株耐药株SNQ2表达仅相对升高，这可能说明SNQ2没有单独表达或并非主要外排泵，表明这些ABC转运蛋白之间可能存在相互作用。

PDR1是ABC转运蛋白家族的上游调节基因。研究发现，Pdr1和Pdr3是酿酒酵母中两种密切相关的蛋白同系物，作用与光滑念珠菌中的Pdr1相似。Yao^[13]等在耐药菌株中发现PDR1中的新错义突变位点A848V。Khakhina ^[14]等发现光滑念珠菌PDR1的作用是酿酒酵母PDR1和PDR3自调节转录作用的结合，PDR1自调节在光滑念珠菌耐药性产生中起重要作用。PDR1基因的功能获得性突变（GOF），会导致CDR1表达上调。Hou^[15]等对PDR1多态性进行研究，发现唑类耐药分离株的PDR1多态性比率（14个中的13个，92.9%）明显高于唑类敏感分离株（144个中的28个，19.4%）。

真菌耐药性产生大多缘于基因突变。DNA错配修复（MMR）系统纠正DNA聚合酶在DNA复制过程中产生的错误，以及修复由环境因素或内源性因素引起的DNA损伤。MSH2为该修复系统的关键基因之一。

Healey^[16]等发现有55%携带MSH2功能丧失的突变（LOF），导致体外和体内抗真菌药物耐药性的加速出现，这些突变在氟康唑处理后更为常见。但也有研究表明MSH2序列与氟康唑耐药性或基因型增加之间无明确关联，在这些研究中MSH2被认为是光滑念珠菌的管家基因，即该基因的多态性可能与遗传复合物的差异有关，而与抗真菌药物耐药性不直接相关^[15,17]。尽管如此，不能否认MSH2功能丧失的突变引起错误的不匹配修复，进而参与真菌耐药性的发展，其相关性仍有待进一步研究。

β-葡聚糖是念珠菌细胞壁的基本成分，棘白菌素类药物通过抑制β-1,3-葡聚糖的合成，对念珠菌属发挥杀真菌活性。

多项研究表明，FKS基因突变导致其结合位点改变是棘白菌素耐药性产生的主要原因。Wang^[10]等研究2株耐药分离株，对FKS测序显示，2种分离株在FKS2中都含有S663P突变且存在4个单核苷酸多态性（SNP），而FKS1则无突变。同时，FKS1和FKS2的表达均上调。Al-Baqsami^[18]等在5种耐米卡芬净的分离株中，发现4株分离株FKS2含有非同义（S663P）突变，1株分离株含有FKS2热点-1（HS1）中的三核苷酸缺失（对应于F659；ΔF659）。Pham^[19]等在1037株耐棘白菌素光滑念珠菌中进行FKS测序，检测出47株具有FKS突变。其中，检测出12种独特的突变：FKS1中的5种（15株）和FKS2中的7种（35株）。所有突变都发生在HS1中，没有检测到HS2突变。通过以上研究结果，可推测影响光滑念珠菌对棘白菌素易感性的大多数突变位于FKS1 HS1和FKS2 HS1区域，且FKS2的突变多于FKS1。

多烯类药物是广泛运用于临床的抗真菌感染的广谱抗菌药。两性霉素B是多烯类的代表药物，通过结合念珠菌细胞膜上的麦角甾醇，形成孔道，以改变念珠菌细胞膜通透性从而使念珠菌死亡。

真菌能够自身合成甾醇中间体完成代谢，但麦角甾醇缺乏，导致两性霉素B无作用靶点。Hull等^[6]在多种临床耐药分离株中发现CG156分离株内仅可检测到14α-甲基化甾醇中间体这一种甾醇，即这种分离株内缺乏麦角甾醇，但该耐药株仍可以在没有外源性供应甾醇的情况下，用14α-甲基化甾醇中间体合成细胞所需的甾醇。

由ERG6中密码子Tyr192、Trp286或Leu341无义突变导致Erg6蛋白的过早终止；由ERG2中含有的G122S和G119S无义突变导致Erg2蛋白功能受损，最终均导致突变株细胞膜缺乏麦角甾醇，进而破坏细胞膜通透性和流动性^[20-23]。

综上所述，光滑念珠菌作为临床上较为重要的致病菌之一，由于抗真菌药物种类有限，临床应用重复率高，导致的耐药问题日益严重。因此，一方面需要临床合理用药、联合用药，尽量避免耐药性的产生；另一方面，需要研发新型抗真菌药物。有研究表明^[24-28]，阿魏酸与卡泊芬净，薄荷醇、百里酚、替加环素、绒毛钩藤不溶性成分与唑类药物的协同作用，通过损伤念珠菌生物被膜等方式，可以有效降低唑类耐药菌的MIC。也有研究开辟新的思路，寻找新的药物靶点：合成的铋纳米颗粒可以潜在地用于改善氧化应激和各种微生物感染，对念珠菌病病例有强大抗真菌能力^[29]；4种双鸟胍衍生物（BG1-BG4）对光滑念珠菌和白念珠菌的MIC在2~15.6 μg/ml之间，其中BG3作用于DNA，扰乱复制转录过程，导致在细胞质膜外层的磷脂酰丝氨酸暴露，半胱氨酸蛋白酶活化，促进真菌细胞凋亡^[30]。药物研发和探索是漫长的过程，需要一代代人的验证和实践，但可以预见，在不久的将来，这些药物最终会有一部分应用于临床实践中，为缓解临床耐药问题提供新的选择。