Effect and mechanism of Bajitianwan on preventing D-galactose-induced osteoblast bone loss

成骨细胞：新生24 hWistar大鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司）；胎牛血清（美国Gibco）；MTT（上海博光）；BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒、ALP试剂盒（南京建成）；ROS检测试剂盒（上海碧云天）；α-MEM培养基（天津灏洋）；AKT、p-AKT抗体（美国CST）、Nrf2、HO-1、NQO1抗体（英国Abcam）。

采用二次消化法从新生24 hWistar大鼠颅盖骨中分离提取成骨细胞，将原代成骨细胞培养于α-MEM培养基中（10%胎牛血清），置于37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养，取第3~5代成骨细胞进行后续指标检测。

将细胞以5×10³个/孔接种于无菌96孔板中，孵育24 h。空白组和模型组更换新的完全培养基，给药组分别加入含不同浓度的BJTW水提物的完全培养液（0.001、0.01、0.1、1、10 μg/ml），4 h后模型组和给药组给予D-gal母液进行干预，使完全培养基中D-gal浓度达到100 mol/L。培养48 h后，采用MTT法测定细胞增殖水平。

将细胞以2×10⁴个/孔接种于无菌24孔板中，孵育24 h细胞完全贴壁后，空白组和模型组更换新的完全培养基，给药组分别加入含不同浓度的BJTW完全培养液（0.1、1、10 μg/ml），4 h后模型组和给药组给予D-gal母液进行干预，使培养基中D-gal浓度达到100 mmol/L。培养48 h进行染色，于室温进行避光孵育3 d，洗去工作液后拍照。

ALP活性检测：按照“1.3”项的方法进行给药，细胞培养48 h后，取上清液，根据说明书测定ALP活性。

将细胞以2×10⁵个/孔接种于6孔板中，孵育24 h细胞完全贴壁后，根据分组加入含不同浓度的BJTW完全培养液（0.1、1、10 μg/ml），4 h后模型组和给药组加入D-gal母液，使其浓度达到100 mmol/L。培养48 h后，吸弃上清液，参照ROS检测试剂盒说明书，装载稀释后的DCFH-DA探针，37 ℃孵育20 min，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞并转移至离心管，空白培养基洗涤3次，用300 ml PBS重新混悬细胞后送往流式细胞仪进行检测。

将细胞以2×10⁵个/孔接种于6孔板中，孵育24 h细胞完全贴壁后，根据分组分别加入含不同浓度的BJTW完全培养液（1、10 μg/ml），4 h后模型组和给药组加入D-gal母液，使完全培养基中D-gal浓度达到100 mmol/L。孵育48 h后，吸去上清液，PBS洗涤2次。于冰上对细胞进行裂解提取总蛋白，采用BCA试剂盒对蛋白定量。蛋白变性后，经SDS-PAGE凝胶电泳后转移至PVDF膜进行转膜，室温封闭后，加入相应的一抗（4 ℃环境过夜），1×TBST洗涤3次，加二抗于室温孵育1 h。1×TBST洗涤3次，采用ECL化学发光试剂盒检测。

将细胞以1×10⁵个/孔的密度接种于激光共聚焦皿中，根据分组分别加入含不同浓度的BJTW完全培养液（1、10 μg/ml），4 h后模型组和给药组给予D-gal母液进行干预，使培养基中D-gal浓度达到100 mmol/L。于皿中培养48 h后，弃上清液，PBS洗涤2次后，组织固定液固定细胞，30 min后用PBS清洗2次，加入0.5%Triton X-100通透20 min。PBS清洗2次，皿中加入5%BSA工作液，室温封闭1 h。PBS清洗后加入一抗（4 ℃冰箱过夜），PBS洗涤皿底，加入荧光二抗，于室温环境孵育45 min，PBS清洗皿底，加入DAPI染液，避光环境放置20 min，清洗去除多余的染液，激光共聚焦显微镜拍照。

实验结果用（$ \bar{\mathrm{x}} $±s）表示。采用SPSS 22.0软件、单因素方差分析（One-Way ANOVA）方法对实验数据进行分析。

D-gal损伤可显著抑制成骨细胞的增殖；药物干预后，BJTW在0.1、1、10 μg/ml浓度下均能够显著提高成骨细胞的MTT水平，增强D-gal损伤成骨细胞的增殖（图1A）。

ALP源自成骨细胞的分泌，能够反映骨形成的能力。对给予D-gal干预的成骨细胞所分泌的ALP的活性进行测定。D-gal损伤成骨细胞后，其ALP活性显著降低；药物干预后，BJTW在0.1、1、10 μg/ml浓度下均可提高D-gal损伤成骨细胞的ALP活性(图1B)。

与此同时，在ALP的催化下，甲苯胺蓝（BCIP）的水解产物会和氯化硝基四氮唑兰（NBT）反应产生不溶的深蓝色至蓝紫色甲瓒结晶。BJTW在0.1、1、10 μg/ml的浓度下均可显著增加培养皿底的甲瓒结晶的颜色深度（图1C），证明其可显著提高D-gal损伤细胞的ALP活性，促进成骨分化。

如图2所示，D-gal损伤成骨细胞后，胞内ROS活性显著升高。药物干预后，BJTW在0.1、1、10 μg/ml浓度下均可显著降低D-gal损伤成骨细胞内ROS水平，缓解氧化应激，且该作用呈剂量依赖。

外源性氧化应激会激活细胞内的PI3K/AKT信号通路，使AKT磷酸化水平上升^[6]。如图3所示，D-gal损伤成骨细胞后，p-AKT/AKT水平较空白组显著升高；药物干预后，BJTW在1、10 μg/ml浓度下对p-AKT/AKT的水平的促进作用相较模型组表现更为显著。此外，BJTW还可显著促进其下游蛋白Nrf2、HO-1和NQO1的表达，进而激活氧化应激相关PI3K/AKT通路，缓解氧化损伤。

Nrf2通路同样是抗氧化的关键通路，在ROS清除方面发挥重要作用。如图4所示，BJTW可显著促进Nrf2的入核表达(图4)，提示BJTW抗氧化、促进骨形成作用与激活Nrf2/AKT通路、促进Nrf2入核有关。

成骨细胞主要由骨髓间充质干细胞分化而来，在维持骨稳态和骨重建过程中起着至关重要的作用^[7]。与此同时，成骨细胞还是骨形成的主要功能细胞，在骨形成过程中经历增殖、分化、矿化和凋亡四个阶段^[8-9]。成骨细胞的增殖水平体现骨形成的强弱，其分泌的ALP是成骨细胞分化阶段的关键酶，可介导骨组织矿化^[9-10]。ROS是细胞信号传递和其他生理功能所必需的，然而过多的ROS会导致细胞内的氧化还原反应失衡，扰乱正常的生物功能，导致氧化应激^[11-12]。本研究中，D-gal损伤成骨细胞后，细胞的增殖及骨形成指标ALP水平明显降低，细胞内活性氧水平显著上升，而巴戟天丸能够显著促进D-gal损伤成骨细胞的增殖能力和ALP活性，并能显著降低细胞内活性氧水平，表明巴戟天丸可通过抑制胞内ROS释放缓解成骨细胞氧化应激，从而增强成骨细胞的活性，以促进骨的形成。

作为主要的氧化应激调控因子，在骨代谢调控中，Nrf2同样起着重要的作用^[13-14]。研究发现，敲除Nrf2基因的小鼠，其股骨的骨密度和骨量显著降低，骨小梁面积减少^[15]；同时缺失Nrf2会抑制成骨细胞抗氧化酶的表达，提高胞内ROS水平，从而抑制成骨细胞的分化^[16]。此外，PI3K/AKT通路作为Nrf2的上游信号通路，在氧化应激调控方面同样起到关键作用^[17]。本研究中，药物干预后，巴戟天丸可促进成骨细胞内AKT磷酸化增加，促进Nrf2入核，同时激活下游的HO-1和NQO1的表达，表明巴戟天丸可能通过激活PI3K/AKT和Nrf2信号通路，进而促进通路中相关的蛋白表达，进而增加成骨细胞的抗氧化应激水平，促进骨形成。本研究可为老年性骨质疏松症的临床用药提供一定的实验依据。