Study on the Quality Control Standard of Lvxintong Rugao

Agilent 1260高效液相色谱仪，OpenLAB CDS色谱工作站，ZORBAX SB-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；酮康唑对照品（含量99.0%，批号：100296-201302）、哈西奈德对照品（含量99.2%，批号：100146-201504）、新霉素标准品（652单位/mg，批号：130309-201512）均购自中国食品药品检定所；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。氯新酮乳膏[批号：20190620，20190624，20190628，规格：10 g/支，其中：酮康唑1%（g/g），哈西奈德0.1%（g/g），硫酸新霉素5 000单位/g]由本院制剂室提供。

取本品1.0 g，加甲醇3 ml，搅拌2 min，分取甲醇溶液并过滤，于水浴上蒸发至干，向残渣加入甲醇0.5 ml，搅拌1 min，置离心管中，于冰水浴中冷却1 h，取出后迅速离心，取上清液作为供试品溶液。另取哈西奈德对照品1 mg、酮康唑10 mg分别加甲醇0.5 ml，振摇使溶解（必要时超声），作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2020版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各10 µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（3∶1∶0.5）为展开剂，展开，以碘蒸汽显色，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品未见干扰（见图1）。

取本品约1.5 g（相当于硫酸新霉素7 500单位），置具塞离心管中，加三氯甲烷10 ml与水15 ml，强烈振摇，离心，取上层清液，作为供试品溶液。另取硫酸新霉素标准品，加水制成每1 ml约含2 mg的溶液作为标准品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2020版四部通则0502）试验，吸取上述两种溶液各10 µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲醇-三氯甲烷-氨水（13.5 mol/L）（60∶20∶40）为展开剂，展开，晾干，喷以1%茚三酮正丁醇溶液，在105 ℃加热2 min，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品未见干扰（见图2）。

哈西奈德和酮康唑对照品溶液：精密称取酮康唑对照品49.98 mg，哈西奈德对照品10.02 mg，置25 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制备对照品溶液（酮康唑为1.999 mg/ml，哈西奈德为0.400 8 mg/ml）。

新霉素标准品溶液：精密称取新霉素标准品约250.08 mg于25 ml的量瓶中，加水适量溶解并定容至刻度，摇匀，即为新霉素储备液10.00 mg/ml，相当于6 520单位/ml。精密量取储备液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 ml，置25 ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，获得浓度分别为130.4、260.8、521.6、782.4、1 304、2 608单位/ml的标准品溶液。

哈西奈德和酮康唑供试品：取本品约2.5 g，精密称定，置50 ml量瓶中，加90%甲醇30 ml至80 ℃水浴中加热2 min，振摇使溶解，放冷至室温，加水8.3 ml，再加90%甲醇至刻度，摇匀，于冰水浴中冷却2 h，取出后迅速滤过，弃去初滤液，取续滤液，离心，放至室温，即得。

硫酸新霉素供试品：精密称取本品约7.0 g于锥形瓶中，加三氯甲烷10 ml，振摇使基质分散，加3%盐水10 ml振摇后转移至100 ml分液漏斗中，强力振摇后，静置分层，分取水层置25 ml量瓶中，同法用水提取2次，每次5 ml，合并水层，用水定容至刻度，摇匀，取适量于离心管中，4 000 r/min离心15 min，取上清液，即得。

酮康唑和哈西奈德的阴性对照溶液：按照样品制备方法制备缺酮康唑和哈西奈德乳膏，按照2.2.1.2方法制备阴性对照溶液。

硫酸新霉素的阴性对照溶液：按照样品制备方法制备缺硫酸新霉素的乳膏，按照2.2.1.2方法制备阴性对照溶液。

色谱条件与系统适用性试验：ZORBAX SB-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；以甲醇-磷酸盐缓冲液（pH=7.40）75∶25为流动相，检测波长235 nm，流速1.0 ml/min。

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，结果见图3，供试品溶液中特征峰与对照品峰具有相同保留时间，阴性对照对应位置无干扰。

分别精密吸取对照品溶液1、2、4、5、6、8、10和20 μl，依次进样，测定峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归得，酮康唑：Y=78 309X−180.73，r=0.999 9（n=8）；哈西奈德： Y=18 716X−50.475，r=0.999 9（n=8）。结果表明，酮康唑在1.999~39.98 μg的范围内, 哈西奈德在0.400 8~8.016 μg的范围内呈良好的线性关系。

精密吸取同一混合对照品溶液10 μl，按2.2.2.1项下色谱条件连续进样6次，按峰面积计算，结果哈西奈德和酮康唑的日内精密度RSD值分别为1.1%和0.7%（n=6）；连续进样5 d，记录峰面积，得哈西奈德和酮康唑的日间精密度RSD值为1.2%和0.8%（n=5），表明仪器精密度良好。

取同一批样品溶液（批号：20190620），分别于0、1、2、3、4、5、7和10 h测定，记录峰面积，哈西奈德和酮康唑的RSD为2.1%和1.8%（n=6），表明供试品溶液在10 h内稳定。

取同一批样品6份（批号：20190620），按供试品溶液制备方法项下制备，依法测定，记录色谱图并计算含量。酮康唑和哈西奈德的平均标示百分含量分别为98.21%、103.0%，RSD为1.3%和1.1%，表明方法的重复性良好。

精密称取9份不含酮康唑和哈西奈德的阴性乳膏样品2.5 g，分别按照标示量的80%、100%、120%加入酮康唑（约20、25、30 mg）和哈西奈德（约2、2.5、3 mg）对照品适量，测定含量，计算样品回收率。结果酮康唑的平均回收率为97.75%，RSD为0.77%（n=9），哈西奈德的平均回收率为97.57%，RSD为0.84%（n=9），具体见表1。

3批样品（20190620、20190624、20190628），按供试品溶液制备方法项下制备，依法测定，记录色谱图。结果3批样品哈西奈德的标示量百分含量分别为102.2%、104.5%、99.8%（n=3），酮康唑的标示量百分含量分别为99.2%、98.6%、102.5%（n=3）。

用旋光法对阴性对照溶液进行测定，旋光度为0，表明样品中其他成分和辅料不干扰硫酸新霉素的测定。

取不同浓度的标准品溶液分别测定，以旋光度（Y）为纵坐标，浓度（单位/ml）为横坐标（X），绘制标准曲线，并进行线性回归，得：Y = 8.60E-05 X，r=0.999 8（n=6）。结果表明，新霉素在130.4~2 608单位/ml的范围内呈良好的线性关系。

对同一标准品溶液连续测定6次，旋光度值分别为0.109 6、0.109 8、0.109 2、0.109 5、0.109 5、0.109 8，RSD为1.1%（n=6），表明方法精密度良好。

取同一批样品6份（批号：20190620），按供试品溶液制备方法项下制备，依法测定。计算得到硫酸新霉素平均含量为4 525.7单位/g，RSD为1.6%（n=6），表明方法重复性良好。

取同一批样品溶液（批号：20190620），分别于0、0.5、1、1.5、2、4、6 h测定，计算得到旋光度的RSD为1.1%（n=7），表明在6 h内方法稳定性良好。

取氯新酮乳膏（批号：20190620）约3.5 g，共9份，分别加入新霉素标准品20、25、30 mg，每个浓度制备3份，按照规定制备样品溶液，以标准曲线计算得到的新霉素加标量和实际加入新霉素的量的比值作为回收率，结果见表2。测得百分回收率平均值为98.8%，RSD为2.6%。表明该方法准确率可达到要求。

3批样品，按供试品溶液制备方法项下制备，依法测定，结果见表3。

参照药典及文献[3-4]，对处方中的酮康唑、哈西奈德和硫酸新霉素分别进行了TLC鉴别研究，对样品的前处理方法、展开剂的比例等因素分别进行了考察，确立了最终的TLC方法。结果显示，斑点显色清晰稳定，专属性强，准确性好，基质和溶剂均无干扰，可用于氯新酮乳膏鉴别项下质量控制。

参考药典和文献[5-9]，经紫外扫描，酮康唑和哈西奈德在235 nm处均有最大吸收，故选235 nm作为检测波长。酮康唑和哈西奈德均不溶于水，溶于甲醇、氯仿等，本实验采用甲醇提取，水浴加热，冰浴冷却的方法，可有效除去乳膏剂中的杂质并提取完全。对于流动相的选择，考察了甲醇-水和甲醇-磷酸盐缓冲液为流动相，发现选用甲醇-磷酸盐缓冲液（pH=7.40）75∶25为流动相时，峰形较好，无拖尾。流动相pH值对于两峰的分离度影响较大，如果处理不好会造成峰的重叠，经研究发现甲醇-磷酸盐缓冲液（pH=7.40）为流动相时，可以达到分离效果，且峰形较好。

据文献报道，硫酸新霉素的测定方法主要有微生物法、免疫分析法、色谱法、分光光度法、荧光分析法、电化学分析法、共振散射色谱法和比色法等^[9-15]。药典采用微生物鉴定法，该法操作繁琐，时间较长，重现性很差。硫酸新霉素在紫外区无特征吸收，采用色谱法和分光光度法时，需先进行衍生化处理，但衍生化试剂存在吸收峰，干扰严重，很难分离测定，而HPLC-ELSD法对检测器要求较高。硫酸新霉素具有旋光性，采用旋光法对硫酸新霉素含量进行测定，简单灵便。采用旋光法测定乳膏剂时，将待测药品从基质中提取出来，且保证其他药物无干扰是关键。实验研究发现，在提取过程中加入少量的氯仿溶液强力振摇破乳，使乳膏基质充分分散，有利于药物提取完全；同时，利用三种药物在水中溶解度的区别，硫酸新霉素极易溶于水，酮康唑和哈西奈德几乎不溶于水，采用水提取，4 000 r/min离心15 min，进行样品溶液的制备，可将硫酸新霉素充分分离提取。用旋光法对缺硫酸新霉素的阴性样品溶液进行测定，旋光度为0，验证了样品中的其他成分对硫酸新霉素的测定无干扰，可达到检测目的。经方法学考察，本方法操作简单、结果准确、重复性好、专属性强，可作为氯新酮乳膏中硫酸新霉素的质量控制方法。分别对3批样品的含量进行了测定，3批样品均能达到要求，但含量相对偏低，考虑可能因素是提取过程造成部分损失，以及硫酸新霉素的稳定性等因素造成，需要我们进一步考察研究。