Extraction Technology of Volatile Oil from Wenjing Huoxue Cataplasm

安捷伦1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），FA1604型电子分析天平（上海衡平仪器仪表厂），DHG-9023型电热恒温鼓风干燥箱（上海申贤恒温设备厂），KH-100B型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司），HH-2型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），HA221-40-11 超临界萃取装置（江苏南通华安超临界萃取有限公司）。

川芎（批号：200701）、红花（批号：200801）、羌活（批号：200201）、独活（批号：200301）均购自青岛天成中药饮片有限公司，经山东中医药大学张华教授鉴定川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort的干燥根茎、红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花、羌活为伞形科植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang的干燥根茎和根、独活为伞形科植物重齿毛当归Angelica pubescens Maxim, f. biserrata Shan et Yuan的干燥根，均符合《中华人民共和国药典》（2020年版）中的相关规定，为正品药材；蛇床子素对照品（批号：823A027）、异欧前胡素对照品（批号：A1229A025）均购自北京索莱宝科技有限公司，纯度均>98%；高效液相用甲醇、乙腈为色谱纯（天津四友有限公司）；其余试剂均为分析纯。

按处方比例称取一定量的川芎、红花、羌活、独活药材，放入萃取釜中按设置好的温度和压力加热加压提取至结束后，从解析釜Ⅰ出料口接收黄色膏状提取物，计算所得萃取得率（萃取得率=所得提取物的质量/药材质量×100%）。

精密称定蛇床子素、异欧前胡素适量分别置于25 ml容量瓶中，加甲醇定容后配制成210.40 μg/ml的蛇床子素、163.20 μg/ml的异欧前胡素对照品母液。精密量取蛇床子素对照品母液5 ml、异欧前胡素对照品母液3 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，得混合对照品溶液。

精密称定超临界提取挥发油150 mg于25 ml容量瓶中，加甲醇超声处理后定容，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，得供试品溶液。

按处方比例称取缺羌活、独活的药材，按“2.1”项下工艺操作，同“2.2.2”项下进行样品处理，得阴性供试品溶液。

色谱柱：ZORBAX SB-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm），进样量：10 μl，流速：1.0 ml/min，柱温：20 ℃，检测波长：321 nm。流动相与洗脱条件：A相为乙腈，B相为水。梯度洗脱为：0~8 min，30%→62%A；8~22 min，62%A。

分别精密吸取混合对照品溶液，挥发油供试品溶液，缺羌活、独活的阴性供试品溶液按“2.2.4”项下条件进样测定，记录色谱图。测得成分蛇床子素、异欧前胡素色谱峰达到了较为理想的分离效果，分离度均>1.5，理论板数均≥5 000，且阴性供试品对测定无干扰，混合对照品、供试品及阴性供试品色谱图见图1。

取混合对照品溶液，分别吸取2、5、10、20、30、40 μl注入液相色谱仪，记录峰面积。以对照品溶液的进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得蛇床子素回归方程为Y=28.273X−1.521,r=1.000（n=6）；异欧前胡素回归方程为Y=21.251X+21.496, r=1.000（n=6）。结果表明，蛇床子素在21.04~420.80 μg范围内线性良好，异欧前胡素在12.24~195.84 μg范围内线性良好。

精密量取对照品溶液，按“2.2.4”项下色谱条件重复进样6次，记录各成分色谱峰面积。结果表明蛇床子素、异欧前胡素的峰面积RSD分别为0.98%和0.64%，结果表明仪器精密度良好。

取同一供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h按“2.2.4”项下色谱条件进样测定，记录各成分峰面积，蛇床子素和异欧前胡素的RSD分别为1.50%和1.36%，结果表明所提挥发油在室温条件下24 h内稳定。

同样的条件下制备供试品溶液6份，按“2.2.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量，结果蛇床子素和异欧前胡素的平均含量分别为17.34 mg/g和8.09 mg/g，RSD分别为1.85%和1.57%，结果表明该方法重复性良好。

取已知含量的挥发油供试品6份，分别精密称定50 mg于10 ml容量瓶中，按药材成分含有量1∶1的比例，分别精密加入蛇床子素、异欧前胡素对照品按“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.2.4”项下色谱条件进行含量测定，测定两种成分的平均加样回收率为100.01%和99.65%，RSD分别为1.10%和1.13%，表明该方法稳定可行。

取各操作下的供试品溶液，按“2.2.4”项下色谱条件分别进样，记录峰面积，按外标一点法进行所测指标的含量测定，测定结果如表1所示。

影响超临界提取挥发油的主要因素有萃取温度、分离斧Ⅰ温度、萃取压力和萃取时间等，按照“2.1”项下实验方法，以萃取得率、蛇床子素含量和异欧前胡素含量的综合评分为考察指标综合评价^[6-7]，各指标权重系数分别为：0.40、0.30、0.30，综合评分公式：Y（得分）=（本组萃取得率/最高组萃取得率×0.40+本组蛇床子素含量/最高组蛇床子素含量×0.30+本组异欧前胡素含量/最高组异欧前胡素含量×0.30)×100，考察萃取温度（40、45、50、55、60 ℃）、分离斧Ⅰ温度（40、45、50、55、60 ℃）、萃取压力（20、25、30、35、40 MPa）、萃取时间（1、2、3、4、5 h）对所提挥发油的影响。采用控制变量的方法，当改变其中一个因素时，其余因素为萃取温度40 ℃、分离斧Ⅰ温度40 ℃、萃取压力20 MPa、萃取时间1.0 h，确定各因素的大致范围，实验结果如图2所示。

由图2可得，在萃取温度，分离斧Ⅰ温度、萃取压力、萃取时间4个影响因素中，萃取温度、萃取压力、萃取时间3个因素对挥发油综合评分影响较大，而分离斧Ⅰ温度影响较小，故确定后续操作在分离斧Ⅰ温度为50 ℃的基础上，萃取温度选取50、55、60 ℃ 3个水平，萃取压力选20、25、30 MPa 3个水平，萃取时间选取2、3、4 h 3个水平进行正交试验。

对单因素试验结果进行分析，确定以萃取温度、萃取压力、萃取时间为考察因素，采用 L₉（3⁴）正交试验法，优选最佳提取工艺条件。具体因素水平表见表2。试验设计及结果见表1，方差分析结果见表3，统计分析使用SPSS 22.0软件。

由极差分析可以得出影响所提药材综合评分的因素大小为A>B>C,即萃取温度>萃取压力>萃取时间，各因素水平的强弱顺序为：A₂>A₃>A₁，B₃>B₂>B₁,C₃>C₂>C₁。同时方差分析结果表明因素A萃取温度和因素B萃取压力对于超临界所提挥发油的综合评分有显著性影响, 因素C萃取时间的3个水平相差不大，无显著影响。结合极差分析和方差分析结果，在综合考虑实际操作的前提下,为获得好的提取效果，确定因素A选择水平2，因素B选择水平3，因素C选择水平1，即本试验最佳提取工艺组合为A₂B₃C₁，萃取温度为55 ℃，萃取压力为30 MPa，萃取时间为2 h。

按比例称取3份同一批号的处方量药材，按照正交试验优选条件进行萃取，测定所得挥发油的萃取得率和每1.00 g萃取物中所含蛇床子素、异欧前胡素的含量，实验结果如表4所示。计算其相应结果得平均萃取得率为3.77%，RSD为1.56%，蛇床子素平均含量为27.41 mg/g，RSD为1.66%，异欧前胡素平均含量为12.69 mg/g，RSD为1.28%，表明正交试验所得萃取工艺条件稳定可行。

本实验对甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸水作为流动相进行比较，结果显示乙腈洗脱能力较甲醇更好，出峰时间早且分离好，乙腈-水与乙腈-0.1%磷酸水相比得出的图无明显区别，表明调节洗脱液酸碱性对分离物质无太大影响，故流动相选择乙腈-水。波长选择为321 nm是因为在该波长处蛇床子素、异欧前胡素均有较好吸收。

　　本次实验中选择蛇床子素、异欧前胡素为液相检测指标，其中蛇床子素具有抗炎、抗氧化、抗血栓及抗血小板凝聚等作用，是独活发挥其祛风除湿、通痹止痛功效的主要药效成分^[11-12]。羌活具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌细胞增殖、抗血栓等作用，而异欧前胡素作为羌活的重要活性成分，故将其作为本次实验的考察指标^[5]。同时未考察红花中活性成分是因为红花主要活性成分为羟基红花黄色素A，虽然其同样具有活血化瘀的药理作用，但其溶解性为水溶性，不在挥发油成分中。川芎的主要药效成分——阿魏酸，虽具有抗氧化、抑菌消炎、抗血栓的作用，但在经液相检测过程中发现挥发油中虽含阿魏酸，但其提取量过低且在阿魏酸出峰位置有其他物质干扰，经调节流动相比例和切换检测波长等方法未将其去除，故未将其列入检测指标范围内。

常用的挥发油提取方法有水蒸气蒸馏法、超临界CO₂萃取法等。水蒸气蒸馏法是指将药材用水浸泡后，采用直接加热蒸馏或通入水蒸气蒸馏，使挥发油与水共同蒸馏出来后收集馏液，冷却后分离油层的方法。超临界CO₂萃取法是指应用CO₂超临界流体提取植物的挥发油，该方法较水蒸气蒸馏法可以有效防止挥发油中易热解成分的破坏且可以提高产品质量和提高收率。