Effects of liver-specific Nampt knockout on ischemic stroke

Nampt^loxP/loxP小鼠(南京医科大学王强教授实验室赠予)和Albumin-Cre小鼠(上海南方模式生物科技发展有限公司)。动物自由饮水、进食；环境温度控制在(25±1) ℃，相对湿度40%～60%，昼夜均为12 h。所有动物实验均符合实验动物伦理学要求。

PCR仪(TaKaRa)，M200 PRO多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)，SC12型水平电泳槽(北京凯元信瑞仪器有限公司)，FR-980A生物电泳图像分析系统(上海复日科技有限公司)，红外激光扫描成像系统(LI-COR)，蛋白电泳、转膜系统(上海天能科技有限公司)，高通量组织研磨仪(上海万柏生物科技有限公司)，颅骨钻(广州坤图生物科技有限公司)，CHR多功能手术仪(武汉春光医疗美容仪器有限公司)。

小鼠鉴定引物(上海生工生物工程股份有限公司)序列如表1所示。

鼠尾基因组DNA提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)，多聚甲醛(博光生物科技有限公司)，GAPDH抗体和BCA蛋白浓度试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，PBEF抗体(F-8)(Santa Cruz Biotechnology)，Premix Taq^TM (TaKaRa)，硝酸纤维素转移膜(Whatman)，IRDye^®800CW Donkey anti-Mouse IgG二抗(LI-COR)，血浆Visfatin 检测试剂盒(Phoenix Pharmaceuticals, Inc)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(BBI Life Science)，异戊巴比妥(BIOSZUNE LIFE SCIENCES DEP)，水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)。

白蛋白(Alb)仅在肝脏中表达。目前，Alb基因启动子作为肝脏特异性启动子被广泛用于制备肝脏特异性基因敲除小鼠模型^[16]。Nampt^loxP/loxPAlb-Cre及其同窝对照Nampt^loxP/loxP小鼠由Nampt^loxP/loxP和Alb-Cre两种小鼠杂交获得。培育过程如图1：①将Nampt^loxP/loxP 小鼠与Alb-Cre小鼠交配，筛选获得Nampt^loxP/WTAlb-Cre，②Nampt^loxP/WTAlb-Cre与Nampt^loxP/loxP小鼠交配，得到Nampt^loxP/loxPAlb-Cre，③最后将Nampt^loxP/loxPAlb-Cre与Nampt^loxP/loxP交配，得到用于实验的Nampt^loxP/loxPAlb-Cre(即liver-specific Nampt knockout mice，以下简称LNKO)及其同窝对照Nampt^loxP/loxP小鼠(以下简称WT)，用引物1对其子代进行基因型鉴定。实验中①②③交配使用的Nampt^loxP/loxP 小鼠全部用Nampt^loxP/loxP与Nampt^loxP/loxP小鼠交配所得，用引物2对其子代进行基因型鉴定。

剪取5周龄小鼠尾巴约0.5 cm。置于1.5 ml离心管中，剪碎后，按照鼠尾基因组DNA提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)说明书进行提取。

扩增小鼠DNA，扩增程序如图2，扩增体系20 μl：Premix Taq^TM 10 μl，引物1 μl (5 μm)，DNA溶液2 μl，ddH₂O体积为7 μl，混合均匀后放入PCR仪进行扩增。Nampt^loxP/loxPAlb-Cre与Nampt^loxP/loxP交配得到的子代用引物1和扩增程序图2A进行鉴定，Nampt^loxP/loxP 与Nampt^loxP/loxP交配得到的子代，理论上都为Nampt^loxP/loxP，用引物2和扩增程序图2B进行鉴定。

配制2%的琼脂糖凝胶(琼脂糖凝胶未凝固前每10 ml加入1 μl的gelRed试剂)，在水平100 V电泳槽中电泳30 min。

最后用生物电泳图像分析系统，在312 nm紫外线下拍摄成像。

用1%异戊巴比妥腹腔麻醉小鼠(100 mg/kg)，心脏取血后，取出小鼠的肝脏、脑，用高通量组织研磨仪对组织进行匀浆，在4 ℃，12 000×g的条件下，离心20 min后取上清液，用BCA法进行蛋白定量，通过蛋白免疫印迹法检测Nampt蛋白。

用4%水合氯醛腹腔麻醉小鼠(400 mg/kg)，将小鼠固定在鼠板上，剔除左眼周围的毛发后，酒精棉球消毒，用镊子揪起左耳外耳道和左眼外眦之间的皮，平行于下层肌肉表面做1 cm切口，分离头骨外周肌肉，用颅骨钻在颞骨前下紧邻颧弓前上缘的部位打磨使颞骨变薄，用镊子去除部分头骨，在手术显微镜下找到大脑中动脉，并用电凝器凝断位于嗅束至大脑下静脉之间的主干，再缝合伤口。术后将小鼠置于保温毯上，待清醒后放回动物笼内饲养。

神经行为学损伤评分采用5分法^[17]。0分：正常，无神经功能缺损；1分：瘫痪侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损；2分：行走时，小鼠向瘫痪侧转圈，中度神经功能缺损；3分：行走时，小鼠身体向瘫痪侧倾倒，重度神经功能缺损；4分：不能自发行走，有意识丧失。

MCAO造模24 h后将小鼠麻醉，断头取出脑，放入−20 ℃冷冻15～20 min，再用刀片将全脑冠状切出6片1 mm厚的脑片，去掉尾部带有嗅球、小脑和低位脑干的部分。脑片用37 ℃预热的2% TTC染色，37 ℃避光染色30 min，正常组织为红色，梗死组织为白色。4％多聚甲醛固定1 h后，用滤纸吸干液体再取出脑片，用扫描仪扫描脑片，用Image J计算梗死面积，以测量梗死脑组织体积占总测量脑片体积的百分比作为衡量脑梗死的指标。每片切片的脑梗死体积=(该切片双面梗死面积之和÷2)×层厚，相对脑梗死体积(%)=(全部切片梗死体积之和÷全部切片体积之和)×100%。

小鼠心脏取血得到血浆后，用ELISA法测定Nampt的含量。测定步骤按照血浆Visfatin 检测试剂盒说明书进行。

采用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行统计分析，实验数据用($ \stackrel{-}{x} $±s)表示，通过独立样本t检验分析组间差异的显著性，以P<0.05为具有统计学差异。

核酸电泳条带为150 bp+351 bp+390 bp的为Nampt^loxP/loxPAlb-Cre，即LNKO小鼠，核酸电泳条带为351 bp的为Nampt^loxP/loxP，即WT小鼠。小鼠基因型鉴定结果如图3所示，从左到右，泳道1为DNA Maker，泳道2和3为WT小鼠(351 bp)，泳道4和5为LNKO小鼠(150 bp+351 bp+390 bp)。

比较各组小鼠12周龄的体重。如图4所示，WT雄性小鼠的体重为(25.31±1.91) g，LNKO雄性小鼠的体重为(25.19±1.17) g，WT雌性小鼠的体重为(19.79±1.19) g，LNKO雌性小鼠的体重为(20.36±1.79) g。同一性别中，LNKO和WT小鼠体重比较没有显著性差异。WT小鼠中，雄鼠比雌鼠平均重5.52 g(P<0.001)。LNKO小鼠中，雄鼠比雌鼠平均重4.83 g (P<0.001)。以上结果说明特异性敲除肝脏Nampt基因表达，对小鼠的体重无影响。

为进一步验证成功培育肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠，提取各组小鼠的肝脏和脑组织蛋白，通过蛋白免疫印迹验证两种组织中Nampt蛋白的表达。如图5A所示，同一性别肝脏组织中，LNKO小鼠Nampt蛋白表达水平都显著性低于其对照WT小鼠，其中LNKO雄性小鼠Nampt蛋白表达水平比WT雄性小鼠降低了67.1%；LNKO雌性小鼠Nampt蛋白表达水平比WT雌性小鼠降低了81.3%。如图5B所示，在脑组织中，LNKO小鼠Nampt蛋白表达水平与其对照小鼠相比无显著性差异。蛋白免疫印迹结果进一步证明，肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠被成功构建。

根据血浆Visfatin检测试剂盒的数据处理方法，测量Nampt蛋白的标准品(浓度依次为0.1、1、10、100、1000 ng/ml)在450 nm处的吸光度（A）值，对数据进行四参数Logistic曲线拟合得到图6A，R²=1，曲线拟合效果很好。

根据拟合曲线方程和样品的吸光度值，计算各组小鼠血浆Nampt蛋白浓度。如图6B所示，同一性别对应的LNKO与WT小鼠血浆Nampt蛋白浓度无显著性差异，LNKO与WT小鼠的血浆Nampt蛋白浓度也无显著性差异。只有LNKO雄性组的血浆Nampt蛋白平均浓度比LNKO雌性组略升高0.91 ng/ml(P<0.05)。

MCAO造模43只小鼠，成功造模38只，其中WT雄性小鼠11只，LNKO雄性小鼠8只，WT雌性小鼠11只，LNKO雌性小鼠8只，造模成功率为88.37%。

图7A显示各组典型脑片TTC染色，白色是梗死区。图7B代表统计后各组相对脑梗死体积。MCAO造模24 h后，相对脑梗死体积数据如下：WT雄性组为(16.14±1.78)%，LNKO雄性组为(17.71±2.08)%，WT雌性组为(16.85±3.36)%，LNKO雌性组为(18.68±4.50)%。各组在MCAO 造模24 h后的相对脑梗死体积无显著性差异。

神经行为学损伤评分数据如表2所示。造模24 h后，各组小鼠以轻度神经功能损伤为主，瘫痪侧前肢不能完全伸展；每组都存在部分发生中度神经功能损伤，行走时向瘫痪侧转圈。各组在MCAO造模24 h后神经行为学评分无显著性差异，而且各组神经行为学评分高低与相对脑梗死体积一致。

MCAO造模24 h后，各组血浆Nampt蛋白平均浓度：WT雄性组为(6.26±0.98) ng/ml，LNKO雄性组为(6.44±1.03) ng/ml，WT雌性组为(5.28±0.86) ng/ml，LNKO雌性组为(5.70±0.80) ng/ml。如图8所示，LNKO及其同窝对照WT小鼠在MCAO造模24 h后血浆Nampt蛋白表达无显著性差异。

本研究利用Cre/loxP重组酶系统成功构建肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠，并证实肝脏来源Nampt对缺血性脑卒中没有明显保护作用。

Cre/loxP重组酶系统介导的基因打靶方法是目前应用最为广泛的基因条件性敲除方法。 loxP序列中的特殊回文结构可以被Cre酶特异性识别结合并催化两个loxP序列之间的片段发生同源重组，进而实现对该片段的基因敲除。我们通过基因鉴定和肝脏Nampt蛋白免疫印迹从基因和蛋白两个层面对该动物模型进行验证，结果都表明小鼠肝脏Nampt基因被特异性敲除。以同窝对照为阴性对照，监测两组小鼠的一般状况，发现其体重、活动状态等无显著差异。有研究曾比较10、55、110周雌性肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠与对照小鼠体重，两者无显著性差异，这与本研究结果一致^[16]。

Nampt是一种脂肪细胞因子，可由脂肪组织大量分泌。除此以外，其他如肝细胞，白细胞，单核细胞，B细胞，心肌细胞和各种神经细胞也可分泌Nampt，目前认为脂肪、肝脏和白细胞是血液Nampt来源的主要器官^[3]，但是血液中Nampt的各组织分泌的贡献率并不是十分清楚。本研究首次显示特异性敲除小鼠肝脏Nampt基因的表达并不能显著影响生理情况下血浆Nampt蛋白浓度，这是基于肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠的一个在体研究结果，不同于前期的相关研究。前期研究报道了肝脏HepG2细胞^[15]、大鼠来源肝细胞^[14-15]和原代人的肝细胞^[15]可以大量分泌Nampt蛋白，这些结论主要基于的都是体外的细胞实验，没有研究整体的动物和人。本研究结果说明生理状态下肝脏Nampt的分泌水平可能相对较低，对血液Nampt的贡献率不如脂肪组织。肝脏特异性Nampt基因敲除导致的Nampt分泌减少在生理状态下可能仍然能够被脂肪等组织很好地代偿，因而血浆Nampt水平不改变。在这点上，脂肪特异性Nampt基因敲除对血液Nampt水平的影响更大。Yoon等^[18]发现雌性脂肪特异性Nampt基因敲除鼠的血浆Nampt水平显著低于雌性对照鼠。此外，研究结果说明肝脏特异性敲除Nampt基因表达后，性别因素并不显著影响肝脏对血液Nampt的贡献率，这与脂肪特异性Nampt基因敲除小鼠有所不同^[18]。

但是肝脏特异性Nampt基因敲除是否影响外周血Nampt水平还可能与病理状态和禁食因素等有关。有研究报道与健康对照组相比，肝硬化患者的血液Nampt水平显著升高^[19]，提示病理状态时肝脏对血液Nampt的贡献会发生改变。另一方面， 血液Nampt水平受禁食因素影响，所以检测结果和动物进食状态有关。有研究发现禁食会升高Nampt血液水平^[18]。本研究在未禁食下检测，肝脏特异性Nampt基因敲除不改变血液Nampt水平。但在禁食状态下，各组织对血液Nampt贡献情况很可能会发生改变，从而引起血液Nampt水平变化。本研究所反映的仅是在非禁食的生理状态下以及脑缺血后的肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠的外周血Nampt水平，在其他条件下肝脏特异性Nampt基因敲除是否对血液Nampt水平有影响有待进一步研究。

本研究的一个重要目的是确认肝脏来源Nampt是否参与脑缺血损伤及修复。在缺血性脑卒中时，机体除了调动脑内细胞的Nampt发挥保护作用，肝脏来源的Nampt是否也参与了机体的内在防御修复作用仍属未知。本研究采用电凝法制备脑卒中模型和肝脏特异性Nampt基因敲除动物开展研究。电凝法手术在直视下操作，手术中出血量少，造模成功率高，导致的脑缺血效果稳定，可模拟永久性脑梗死。造模后小鼠出现轻度到中度神经功能损伤，脑片TTC染色出现白色梗死区域，说明电凝法可成功制备MCAO模型。肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠肝脏Nampt蛋白表达下降，而脑内Nampt蛋白表达不受影响，非常适合本课题的研究目的。研究结果显示，同一性别，与野生型相比，肝脏特异性Nampt基因敲除并不影响脑卒中的相对梗死体积和神经行为学评分，说明肝脏来源Nampt不主要参与脑缺血损伤及修复。这一结果的原因可能与肝脏来源Nampt对血液Nampt的贡献率不大有关。血液Nampt的水平是外周Nampt发挥脑生物学功能的基础。在正常条件下，本研究已证实肝脏来源Nampt对血液Nampt的贡献率不大。在脑卒中条件下，卒中后24 h肝脏特异性Nampt基因敲除组和对照组小鼠血液Nampt水平无显著性差异，也说明肝脏来源Nampt对卒中后血液Nampt变化的贡献率不大。

本研究显示，肝脏特异性Nampt基因敲除后，雄性小鼠比雌性小鼠血浆中Nampt表达水平略高，但是后续这两种性别小鼠在缺血后脑梗死面积并没有显著性差异。在生理状态下，LNKO雄性比LNKO雌性血液Nampt水平表达略高。脑卒中24 h后，LNKO雄性小鼠比LNKO雌性小鼠血液Nampt水平有升高趋势，但无统计学差异。这两个血液水平的结果是比较一致的。同样，从脑梗死结果来看，虽然LNKO雌性小鼠的脑梗死体积和LNKO雄性小鼠相比无统计学差异，但是有升高趋势。从行为学评分来看，LNKO雌性小鼠的神经功能学损伤评分相比LNKO雄性小鼠也有升高趋势。这两个结果与血液水平也是总体一致的。

血液水平Nampt改变仅仅是影响脑梗死严重程度的一个因素，组织水平Nampt改变也会影响脑梗死程度。不仅如此，动物的个体差异，手术操作的差异，也会影响脑梗死程度。因此，在现有的动物例数下，两种性别的小鼠在缺血后脑梗死面积并没有统计学差异。后续可以考虑进一步扩大例数，确认两种性别小鼠在脑梗死程度上是否存在差别，并同时观察脑组织Nampt水平是否在两种性别小鼠脑缺血模型上有差别，以明确不同性别小鼠外周来源Nampt和脑组织Nampt对卒中的影响是否存在差异。

Nampt是防治脑卒中的内源性靶点^[3]，是兼具有多种重要功能的脂肪因子。已知Nampt 可被分泌入血，血液Nampt具有酶活性，有生物学功能^[12]。外周来源Nampt很可能是机体维持生理稳态，在病理状态下加强防御、促进修复的重要内源性调控因子。因此，确认Nampt的血液来源和探究血液Nampt的潜在生物学功能具有重要意义。本研究首次确认了肝脏来源Nampt对生理状态血液Nampt的贡献情况和对脑缺血损伤的作用，为后续研究打下了重要基础。当然，本研究也存在不足，比如仅观测卒中后24 h的情况，未观察多个时间点的卒中情况，以及卒中慢性恢复期的情况。血液Nampt的另一个主要来源是脂肪，脂肪来源Nampt对血液Nampt的贡献情况已有报道^[18]，但对脑缺血损伤的作用尚未见报道。这些都有待进一步研究探索。