Rapid prediction of antioxidant activity in aqueous extract solutions of melastoma dodecandrum by ultraviolet spectroscopy

DPPH（Sigma-Aldrich公司）。无水乙醇（分析纯，浙江省无锡市展望化工试剂有限公司）。去离子水由Smart2pure超纯水系统制备（Thermo，美国）。共收集10批地稔药材，经浙江省中医药研究院俞忠明副主任中药师鉴定为地稔（Melastoma dodecandrum Lour.），阴干密封保存。紫外光谱采集采用2450系列紫外-可见分光光度仪（岛津，日本）。DPPH自由基清除活性吸光度测定采用SpectraMax 190酶标仪（Molecular Devices，美国）。

称取地稔药材各约5.0 g，分别加入料液比为1∶25～1∶45的去离子水，浸泡30 min，加热回流提取1.5～3.5 h，抽滤后的提取液水浴浓缩后转移至50 ml量瓶，用去离子水定容，共得到34批地稔水提液，采用DPPH法测定其抗氧化活性。地稔水提液的制备条件和抗氧化活性测定方法见文献^[10]。

移取地稔水提液40 μl，加入去离子水3960 μl，10000 r/min离心后取上清液，制得样品溶液。用1 cm光程的石英比色皿采集紫外光谱。光谱扫描波长范围为190～600 nm，波长间隔为1 nm，扫描速度为快速。每次分析前用去离子水校正仪器基线。

以抗氧化活性为Y，以紫外光谱矩阵为X，通过留一法交叉验证确定最优主成分数，建立X对Y的PLS回归模型。采用校正集相关系数（R_cal）、拟合均方根误差（RMSEE）、交叉验证均方根误差（RMSEcv）、验证集相关系数（R_val）和预测均方根误差（RMSEP）对模型的准确性和预测能力进行评价^[11]。首先，比较不同起始波长和终止波长的建模结果，优化光谱波长范围。继而比较原始光谱和光谱经中心化、标准化、Savitsky-Golay（SG）平滑结合一阶导数、SG平滑结合二阶导数、多源散射校正、标准正则变换等预处理后的建模结果，优化光谱预处理方法。最后，基于最优PLS回归模型开发应用软件。数据处理采用SIMCA-P+软件（版本12.0，Umetrics AB，瑞典）。应用软件开发采用Visual Basic软件（版本6.0，Microsoft，美国）。

地稔水提液的抗氧化活性范围为83.4%～98.9%。样品溶液的紫外光谱见图1。随机选择24个样品作为校正集，剩下10个样品作为验证集。采用校正集样品，以抗氧化活性为Y，以190 nm为起始波长，分别以250、280、290、300、400、600 nm为终止波长，将紫外光谱经标准化处理后建立PLS回归模型，优化终止波长，见图2A。结果表明，以290 nm为终止波长所建模型的RMSEcv最小。以抗氧化活性为Y，分别以190、200、210、220 nm为起始波长，以290 nm为终止波长，将紫外光谱经标准化处理后建立PLS回归模型，优化起始波长，见图2B。结果表明，当起始波长为200 nm时所建模型的RMSEcv最小。综上所述，本研究选择200～290 nm为最优波长范围。

以抗氧化活性为Y，采用200～290 nm的紫外光谱，比较原始光谱和光谱经不同预处理后的建模结果，优化光谱预处理方法，结果见表1。综合考虑R_cal、RMSEE、RMSEcv等，本研究选择标准化为最优光谱预处理方法。

采用200～290 nm的紫外光谱，经标准化预处理后建立最优PLS回归模型，校正集预测值与真实值之间的相关图（图3），R_cal、RMSEE、RMSEcv分别为0.887、2.20%、2.17%。基于最优PLS回归模型开发应用软件，将所建预测模型嵌套入软件。软件双击即可打开，操作界面见图4。采用该应用软件，通过2个步骤即可实现待测地稔水提液抗氧化活性的快速预测。步骤1：将待测地稔水提液稀释后，采集紫外光谱，检测波长为200～290 nm。步骤2：通过软件中的预测功能将紫外光谱数据自动代入模型，在2 s内实现地稔水提液抗氧化活性的快速预测。

采用所开发的软件预测验证集样品的抗氧化活性。对比验证集抗氧化活性的预测值和真实值，验证本方法的准确性。验证集预测值与真实值之间的相关图见图3，预测回收率见表2。结果显示，验证集抗氧化活性的预测值和真实值差异较小，R_val、RMSEP分别为0.868、2.08%，平均预测回收率为（100.1±2.3）%，表明该方法的预测准确度较高。

地稔是我国的民间常用药，在畲族等少数民族民众中广泛应用，具有较好的临床价值，但仍缺少有效的质量控制方法。现代药理学研究表明，地稔提取液有较强的抗氧化活性，但不同采收时间、不同部位地稔的质量有较大的差异^[12-13]。因此，建立地稔抗氧化活性的快速预测方法对其质量控制具有重要意义。

目前，将光谱技术应用于食品、中药等抗氧化活性的快速预测已有较多文献报道^{[6-9, 14]}，但多以近红外光谱为主。紫外光谱是一种基于分子中价电子能级跃迁的电子光谱技术，具有快速、简便、绿色、灵敏度高等优势。目前，紫外光谱技术已广泛应用于中药活性成分的快速预测^[15-17]，但在中药抗氧化活性的快速预测方面仍罕见文献报道。课题组前期研究表明，地稔水提液紫外光谱的吸光度与其活性成分没食子酸、阿魏酸、芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量具有相关性^[11]。另有研究表明，地稔水提液的抗氧化活性与多种活性成分的含量呈浓度依赖性^[18]。基于上述结果，推测地稔水提液紫外光谱的吸光度可能与其抗氧化活性具有相关性。鉴于此，本研究通过探索地稔水提液紫外光谱与抗氧化活性的相关性，建立了基于紫外光谱的地稔水提液抗氧化活性快速预测方法。为了增加模型在不同紫外光谱仪间的适用性，本方法可选择性采用无水乙醇200 nm的吸光度进行校正^[11]。采用本方法，抗氧化活性预测值与真实值的R_cal、RMSEE、RMSEcv分别为0.887、2.20%、2.17%，R_val、RMSEP分别为0.868、2.08%，平均预测回收率为（100.1±2.3）%，可为地稔水提液抗氧化活性的快速预测提供依据。

本方法简单、绿色，无需掌握复杂的回归参数和手动计算方法，也不需要耗费有机试剂，只需将待测地稔水提液用去离子水稀释后，采集并存储200～290 nm的紫外光谱，通过所开发的应用软件即可快速得到抗氧化活性的预测结果。本方法分析时间较短（每采集一张紫外光谱的时间小于1 min，软件预测时间小于2 s），而采用常规方法或在线色谱法测定DPPH自由基清除率至少需30 min。本研究可为进一步完善地稔的质量控制方法提供依据。