Research progress on quantitative detection methods of lateral flow immunochromatography assay

在侧流免疫层析中，标记材料是至关重要的组成部分，它们用于标记免疫反应的产物，并用于可视化检测结果。常用的标记材料可分为三类，分别是有色标记物、荧光标记物和其他标记物，它们都具有不同的优点和适用范围，可以根据具体应用场景进行选择和优化。随着新技术的不断涌现，侧流免疫层析技术的标记材料也将不断发展和创新，为快速、准确、方便的生物检测提供更好的解决方案。

有色型标记物是指可产生肉眼可见颜色的标记物，常用的有色型标记物有胶体金和胶体碳等。

胶体金是一种含有纳米尺寸的金颗粒，通过氯金酸中的金离子还原成金颗粒制备，通常用于标记蛋白质和抗体等生物分子^[8]。胶体金的显色是由于大量聚集从而形成红色条带，是LFIA中最常用的标记材料。胶体金的标记受多种因素影响，如胶体金的酸碱度和配体蛋白的比例等^[9]。胶体金制备方便、非常稳定、吸附能力较强，对蛋白质和其它生物分子具有高亲和力，同时也具有较高的电荷转移值和良好的光信号。徐子健等^[10]使用胶体金作为标记材料检测水果中残留三唑磷，检测限为15 μg/kg，检测时间为5 min。涂晓波等^[11]使用胶体金作为标记材料检测食品中四氢大麻酚，检测限为1 μg/ml，检测时间为5 ～10 min。

胶体碳是碳黑经过表面处理所得。胶体碳灵敏度较高，并且较胶体金材料更加环保，黑色信号更有利于肉眼观测。胶体碳可以与多种生物分子一起功能化，用于检测低分子量和高分子量的分析物^[12]。使用胶体碳的LFIA的灵敏度与酶联免疫吸附测定（ELISA）相当^[13]，但是胶体碳存在不规则形状的大颗粒，非蛋白质和生物分子的特异性吸附是胶体碳存在的主要问题。陈发容等^[14]使用胶体碳作为标记材料制作检测试纸用于检测花生油中黄曲霉毒素B1，结果显示检测限为2.0 ng/g，检测时间为5～10 min，该检测试纸特异性良好，与其他结构类似物无交叉反应。曾艳等^[15]使用SB4型炭黑作为标记材料制作检测试纸，用于呋喃妥因代谢物1-氨基-乙内酰脲的检测，其检测限为0.2 μg/kg，检测时间短，可在15 min内完成。

荧光标记物在特定的光源激发下会产生荧光，常用的荧光标记物有镧系元素、量子点等，目前许多新型荧光标记物也已用于LFIA定量检测。

镧系元素也可称为稀土元素，由于电子壳层间产生跃迁，从而产生强烈的荧光。镧系元素具有灵敏度高、特异性好、稳定性好、动态检测范围广等特点，并且不依赖复杂的专业仪器设备就能即时获得检测结果。李艾哲等^[16]使用铕纳米颗粒制备荧光探针来制作试纸检测猪旋毛虫病，采用15头不同剂量人工感染旋毛虫猪的全血评估试纸的性能，结果显示不同剂量的试纸都呈阳性，使用集样消化法进行检测，结果并未全部呈现阳性，表明该检测方法具有更高的灵敏度，且操作简便，检测限为0.05 ng/ml，仅需5～10 min即可检测出结果。黄文颖等^[17]以羧化铕微球为荧光标记材料制作了试纸检测牦牛肉中磺胺类药物残留，检测限为1.97 μg/kg，所有样品的添加回收率在90%～115%，其中批内离散系数均低于10%、批间离散系数均低于13%。

量子点是一种半导体材料，粒径属于纳米级别。量子点吸收光子后价带的电子跃迁到导带，导带上的电子也可以跃迁到价带发射光子，不同量子点粒子的大小可发出不同波长的光^[18]。量子点具有良好的稳定性和吸收系数，易于与生物分子结合，并且具有水溶性^[19]。由于其独特的光学特性，可用于监测广谱波长等，量子点已经成为有机荧光染料的替代品^[20]。徐志远等^[21]根据非洲猪瘟病毒（ASFV）VP72蛋白的氨基酸序列筛选合成多肽，并与载体蛋白BSA进行偶联，用来制备鼠源抗ASFV-VP72蛋白的单克隆抗体，将该单抗作为荧光量子点标记的抗体，建立了一种简便、快速、准确的用于ASFV抗原检测的荧光量子点免疫层析试纸，结果可知阳性符合率为82.1%，阴性符合率为93.8%，该试纸条特异性好、灵敏度高。毛永强等^[22]使用量子点检测氨苄青霉素，氨苄青霉素在5.0 ～140.0 μmol/L范围内对碳量子点的荧光增强程度呈良好的线性关系，检出限为1.0 μmol/L。

表面增强拉曼技术（SERS）是一项利用金属的纳米结构增强待测物电磁场的技术，从而使吸附于基底上的拉曼信号放大。SERS增强基底常使用贵金属，例如金、银等。可将多种贵金属组合使用制作基底，不同金属内部的纳米结构不同，因此放大信号的能力也不同，可通过改变基底材料的组成、尺寸、间距、聚焦方式等优化基底。SERS常用于食品安全、医疗诊断、生物分析等领域。SERS技术具有优异的特异性和灵敏度，检测结果准确度高，但是同时需要昂贵的拉曼检测仪配合使用。韦伟等^[23]自制金银纳米梭基底，结合癌胚抗原（CEA）的单克隆抗体，实现胃癌的早期诊断。经过实验证明，该检测方法灵敏度高、特异性好，对血清中CEA检测限低至1.22 pg/ml，基于SERS分析平台在胃癌诊断中具有应用价值。冯笛等^[24]基于SERS开发了一种银立方体基底和酶促反应相结合的检测方法检测汗液中的葡萄糖，检测限为0.5 mmol/L，整个过程可在7 min内完成。

最初，研究人员使用胶体金制备试纸条，用于尿人绒毛膜促性腺激素检测，检测结果依据目测判定，但是该检测方法假阴性率高、检测灵敏度低。随着侧流免疫层析技术的发展，也出现了通过图像采集的方法处理检测线的仪器，LFIA测量逐渐实现定量、半定量化。

定量检测的原理是通过对T线和C线的颜色进行定量或半定量分析。为了方便定量检测，通常采用专业仪器测量T线和C线颜色的强度。目前广泛应用的LFIA定量检测仪器主要包括金标检测仪和荧光检测仪，此外，新型的智能手机相机作为检测仪器也开始广泛的应用，可作为家用便携式检测仪进行检测，基于SERS的检测仪等也在逐步的发展研究中。

胶体金检测技术使用纳米级的胶体金作为标记材料并进行检测，表面带负电荷的胶体金颗粒可以与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合^[25]。金标检测仪主要有基于光敏电阻法和图像处理法的检测仪，从而将T线和C线的颜色信号转换成电信号或灰度图像。

基于光敏电阻法的检测仪是基于朗伯-比尔光吸收定律，利用光电二极管接收试纸条反射光，用相关算法对待测区域采样数值进行处理。光敏电阻法是使用光电导探测器，其阻值会随着照射光信号的强度发生变化，因此入射光强时输出电流大，入射光弱时输出电流小，通过拟合待测物浓度与相关检测值的曲线，从而求出未知检测物的浓度。

该类检测仪的结构一般由信号采集板、LED光源、步进电机组成。检测系统通过步进电机对试纸进行扫描，步进电机的固定架与仪器外壳底部固定连接^[26]。试纸两侧位置有光源，试纸条置于信号采集板上。步进电机水平匀速移动，对下方的试纸条进行扫描检测，根据不同测量物选用不同颜色和波长发光二极管作为系统检测的光源。通过光电二极管接收胶体金试纸条反射光，通过计算转换获得检测结果。

利用嵌入式微控制器，软件部分包括主程序、电机控制模块软件、人机交互模块软件、显示模块软件、存储模块软件。这些软件共同完成仪器的检测流程，包括从开机自检到检测完成的全部流程。

王振江^[27]利用绿色光源激发的光敏电阻法开发了一种基于硅光电池的便携金标检测仪。选取0、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1 ng/ml这7种不同浓度的克伦特罗溶液作为样品进行检测，结果显示变异系数分别为2.27%、1.92%、2.13%、2.08%、2.18%、1.8%、2.25%，变异系数均低于3%，证明了该便携检测仪具有较高的稳定性。

基于图像处理的检测仪通过将试纸进行图像信息采集，使用算法进行特定处理，从图像中提取试纸图像的特征值。通常使用CCD或者CMOS来进行光电转换^[28]，当光照射到像元上时产生光电流，光强度越强，在每个像元上累积电荷量就越多。主控芯片获得显色图片后，通过算法处理得到T线和C线的显色结果，图像信息经数据转换后在LCD显示。

该类检测仪的硬件主要包括图像传感器、LED光源、电源。依据胶体金的吸收峰波长以及图像传感器的光谱响应，可以选择不同颜色的LED作为系统照明光源^[29]。输出的图像在电脑上进行分析处理，得出相应的检测结果^[30]。LED光源照射在试纸条带反应区，反射光被图像处理器捕捉，图像传感器将经过滤光片的光信号转化为电信号，通过信号放大等处理后形成原始图像数据。

软件部分是将原始图像数据通过算法进行计算，提取T线和C线的条带信息，获取吸收特征峰曲线，并对曲线进行平滑处理，提取特征峰曲线的特征值并且建立模型，获得浓度拟合曲线，从而输出定量检测值。

郑宇^[31]等开发了一种利用图像处理对尿素酶进行定量检测的检测仪。使用CMOS传感器获取图片信息，然后使用k-means均值聚类算法提取T线和C线，T线和C线被转换成灰白色，并且提取出进行计算。采用该仪器检测了3种不同浓度的试纸条的色带的平均灰度值，检测结果显示差异非常小，波动范围小于3%，设备的检测下限为5 mIU/ml，符合临床检测的需要。

随着许多新型的荧光标记物的广泛使用，也出现了灵敏度更高的荧光检测仪。现有的荧光检测仪主要有基于光电转换的检测仪和智能手机两种模式。基于光电转换的检测仪是通过光电传感器获取T线和C线中的荧光信号并转换成电信号^[32]，这种模式需要完整的机电检测系统，使得整套仪器笨重不方便携带，不利于即时检测。新型检测模式使用智能手机自带的相机，利用手机软件可对荧光及化学发光信号进行分析处理，该检测方法在疾病的家庭自检中具有极大的应用前景。

基于光电转换的检测仪采用光电扫描方式进行荧光层析试条的定量检测^[33]。当激发光照射在层析试条上，荧光标记物获得能量发出荧光，光学传感器捕捉到发出的荧光，进而将光信号转化成为电信号，发出的光信号越强，转换的电信号也就越强，根据荧光信号强度进行待测样品溶液的浓度分析^[34]。

该类检测仪的硬件系统主要由激发光源、光电检测系统、步进电机等组成。随着步进电机在试纸上方匀速运动，激发光扫描整个试条，在激发光和试纸中放置一面二向色镜，二向色镜用来反射激发光照射到试纸上，待测物由于激发光照射发出荧光，被光电二极管接收，根据获取的电信号强弱进行分析，通过滤波放大电路对信号进行放大，通过模数转换器进行分析，得出数据结果。

姜海燕等^[35]利用基于STM32的荧光测流免疫分析仪定量检测C反应蛋白，并通过传统的荧光分析仪平行测定，与该检测装置进行对比，证明其性能。使用3种不同浓度的样品溶液，分别在该检测装置和ESE分析仪进行多次测试，使用检测线峰值和控制线峰值的比值作为信号特征量，检测出该装置的灵敏度为1.95 µg/ml，ESE的灵敏度为1.95 µg/ml，因此该检测仪器的灵敏度较高；线性度测试结果显示，该检测装置的线性相关系数r=0.996，ESE的线性相关系数 r=0.9947，在线性度上该检测装置接近ESE，但ESE检测范围为0.98～32µg/ml，该检测装置检测范围为1.95～256 µg/ml，检测范围更宽；重复性测试结果显示，对应质量浓度ESE的变异系数分别为0.5%、0.2%，该检测装置分别为1.65%、0.6%。由结果可知，该检测装置具有较高的灵敏度、线性度、重复性，可用于临床。

基于智能手机的检测仪是利用智能手机相机进行图像收集，利用手机应用程序对图像进行分析处理。开发适配手机的配件暗盒，其中可插入检测试纸，从而隔绝外部环境光线变化等对结果分析的影响^[36]。暗盒可以通过简单的手动操作使用，因此使用智能手机CMOS相机作为光探测器，非专业操作员也可以进行整个分析。

该类检测仪的硬件系统包括手机配件暗盒以及智能手机，手机配件上包含一个与相机对齐的平凸透镜和一个用于插入暗盒的插槽。

Zangheri等^[37]又开发了一种用于赭曲霉毒素A检测的智能手机定量检测仪，在葡萄酒和速溶咖啡两种基质中获得的校准曲线彼此非常相似，这表明预处理程序有效地去除了可能干扰测定的任何样品组分。该测定还显示出良好的再现性，与校准曲线的点相关的相对标准偏差（RSD）始终低于12%（葡萄酒基质）和7%（速溶咖啡基质）。

SERS作为一种高度灵敏的分析技术，已被用于鉴定各种分析物，如核酸、蛋白质、细菌、细胞和重金属。这种光谱检测方法利用金属表面激发的低能电子使等离子体表面的局域光电场增强，从而引起SERS信号的极大提高。基于SERS的LFIA将SERS的高灵敏度和特异性^[38]与LFIA技术的简单、快速和易于操作相结合，因此非常适合临床POCT。然而基于SERS的LFIA的主要不足是测试结果的读数效率较低^[39]，并且商用的拉曼散射仪价格昂贵。

基于SERS的LFIA读卡器包括LFIA反应通道、二极管激光器、光谱仪、光纤拉曼探头、步进电机、两轴手动可调平移台、光电开关传感器和触摸屏计算机主板。步进电机安装在可手动调节的平移载台上，并且配有支架，装有LFIA试纸的集成LFIA通道安装在固定在步进电机上的支架上，并且可以通过调整两轴平移台上下移动或来回移动。平移级的上下运动可以控制拉曼探头，使其在T线和C线之间切换检测。

史巧巧等^[40]利用基于SERS的检测仪检测猪肉中喹乙醇的浓度。取不同浓度的喹乙醇标准溶液建立标准曲线，结果是随着分析物浓度的升高，拉曼峰强度逐渐降低，在0.1 pg/ml～1.0 ng/ml浓度范围内均呈现较好的线性关系，根据获得的拟合方程，计算出检测灵敏度为0.025 ng/ml，检测限为0.31 pg/ml。测定实验的重现性，在相同浓度的试纸条中，随机测定的点的RSD分别为5.6%、6.3%、3.7%、4.8%和3.1%，说明该方法对于SERS信号检测的精密度较高。

侧流免疫层析检测正在向着精准化的方向发展，传统的标记材料检测灵敏度偏低，因此研究人员致力于研究出更高效的新型标记材料。除了上文中提到的标记材料，还有一些新型标记材料，例如上转换荧光纳米材料，在红外线区域激发，可用于检测核酸、呼吸道合胞病毒等；磁性材料，广泛应用于生物检测和分离之中，纳米级别的磁性材料与抗体结合形成的磁珠可以对分析物进行预浓缩和纯化，从而显著提高灵敏度。随着新型标记物的产生，LFIA的应用也会更加方便和灵敏，趋向家用化，以满足用户日常健康监测的需求。

侧流免疫层析检测仪也正在趋向便捷化。目前胶体金检测仪、荧光检测仪以及基于SERS的检测仪的检测精确度和灵敏度都达到了可用于临床检验的程度，但是对高浓度分析物的检测具有限制、重现性较差。对于胶体金检测仪，光敏电阻法的信号响应会因为T线和C线的宽度受到限制，图像处理法也存在对灰度图像的利用不充分的缺点。目前出现多种新型金标检测仪，可通过分析仪检测T线和C线的温度、气压等变化，经过数字转换获得定量检测结果，灵敏度比光敏电阻法高数十倍。对于荧光检测仪，目前出现的新型智能手机荧光检测仪，可通过使用暗盒避免外界环境带来的影响，进一步提高了准确性，使荧光检测仪摆脱需要专用检测仪的限制，逐渐向家用的方向发展。对于SERS检测仪，其灵敏度高、特异性强、检测速度快，但是SERS基底与生物分子会互相作用影响精度、制备复杂，该技术还处于摸索阶段，仍需大量的临床试验进行验证。

随着新型灵敏标记物、新型LFIA检测仪器的发展和应用，LFIA检测项目会更多、更普及，其操作方式会更加智能、便携、家用，其定量结果输出也会更加快速、灵敏、准确，在即时现场检测领域必将发挥巨大的作用。