Simultaneous determination of five components in Anemarrhenae Rhizoma by HPLC-ELSD

高效液相色谱仪（1260 InfinityⅡ Prime LC, 美国安捷伦公司）；蒸发光散射检测器（G4260B，美国安捷伦公司）；分析天平（XS205，梅特勒-托利多国际公司）、涡旋混合器（SCILOGEX MX-S，美国Scilogex公司）、超声波清洗器（2300TH型，上海安谱实验科技股份有限公司）。

新芒果苷对照品（批号：3671）、芒果苷对照品（批号：5586）、知母皂苷BⅡ对照品（批号：1369）、宝藿苷Ⅰ对照品（批号：1869）、知母皂苷AⅢ对照品（批号：3892）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；知母药材由上海市食品药品检验所中药室赠予；色谱纯乙腈（北京迪科马科技有限公司）；色谱纯异丙醇（上海安谱实验科技股份有限公司）；分析纯乙醇和乙酸（国药集团化学试剂有限公司）。

精密称取芒果苷、新芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ和知母皂苷AⅢ 对照品适量，置于5 ml容量瓶中，加50%乙醇溶液适量，超声溶解后，加入50%乙醇稀释并定容得到混合溶液，精密量取1 ml该混合溶液置于5 ml容量瓶中，加50%乙醇溶液定容，最终得含芒果苷464 μg/ml，新芒果苷482 μg/ml，知母皂苷BⅡ 1084 μg/ml，宝藿苷Ⅰ 106 μg/ml，知母皂苷AⅢ 200 μg/ml的混合对照品储备液，摇匀备用。

取知母药材适量，干燥后粉碎，过3号筛得知母药材粉末。取药材粉末0.5 g，精密称定，置于50 ml具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 ml，称重，超声（功率300 W，60 Hz）处理30 min。超声结束后放置至室温后再次称定质量，使用50%乙醇补足所减失的质量，摇匀后滤过。取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。

色谱柱为Agilent poroshell 120 EC-C₁₈柱（2.1×100 mm，2.7 μm）；流动相为乙腈(A)-0.2%醋酸水(B)；梯度洗脱程序设定为0～3 min，4%～10%A；3～5 min，10%A；5～7 min，20%A；7～11 min，20%～25%A；11～14 min，25%～90%A；14～18 min，90%A；18～19 min，90%～4%A；19～20 min，90%～4%A。柱温为30 ℃；流速为0.7 ml/min。蒸发光散射器的参数设定雾化气温度为40 ℃；漂移管温度为90 ℃；氮气体积流量为2.0 ml/min。供试品进样量为20 μl。混合对照品和供试品色谱图见图1，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ 的保留时间分别为4.05、5.49、11.63、13.85、14.38 min，各成分之间分离度均>1.5。

精密量取1.6 ml混合对照品储备液和0. 4 ml 50%乙醇溶液，涡旋30 s混匀，后使用50%乙醇依次对半稀释。按上述色谱条件进行测定，以峰面积（A）的对数值与进样浓度（C）的对数值进行线性回归，考察结果见表1，表明知母中各成分在相应的浓度范围内均呈现良好的线性关系。

精密吸取混合对照品20 μl，按上述色谱条件连续进样6次，计算5种成分峰面积的RSD值，结果显示，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的RSD分别为1.3%、1.0%、0.9%、1.5%、1.0%、1.4%，表明仪器精密度良好。

称取知母药材粉末0.5 g，精密称定，平行称取6份，按上述操作制备供试品溶液，进样测定，计算新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的含量分别为1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%，RSD分别为1.8%、1.8%、1.4%、2.2%、2.4%，显示方法重复性良好。

称取知母药材粉末0.5 g，按上述操作制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12 h进样测定，结果显示新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的峰面积RSD分别为：2.3%、1.3%、0.9%、3.1%、1.8%，说明样品在12 h内稳定。

称取知母药材粉末0.25 g，精密称定，平行称取6份，分别加入与知母药材粉末各成分含量相近的混合对照品溶液，按上述操作制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率。结果见表2，知母中5种成分的平均回收率为101.8%～105.0%，表明该方法准确度良好。

称取知母药材粉末0.5 g，精密称定，按上述操作进样测定，计算各成分含量，最终计算得新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的平均含量分别为1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%。

本研究首先采用乙腈-水作为流动相，结果发现新芒果苷、芒果苷峰形不佳，色谱峰出现分叉现象。考虑到该两种物质呈弱酸性，故采用乙腈-0.2%醋酸水溶液作为流动相以抑制其解离，结果显示其分叉现象消失，各峰之间的分离度良好，且基线平稳，因此最终采用乙腈-0.2%醋酸水溶液作为最终流动相系统。结果如图2所示。

流动相流出色谱柱后在载气压力的作用下与雾化气体（氮气）在雾化室内混合形成细小的液滴（气溶胶），气体流量越低，形成的液滴越大，散射光越多，分析灵敏度增加，反之越小。但是较低的气体流量会造成溶剂难以蒸发，因此本研究考察了氮气流速分别为1.5、2.0、2.5 L/min时各待测物质的响应值，结果显示，当氮气流速为2.0 L/min 时待测物质响应值最大，信号噪音比率最大，适合分析。

漂移管温度的设置主要取决于流动相的构成、样品的挥发性以及流动相的流速。一般来讲，对于有机溶剂含量比例高、流速低的流动相，其要求的漂移管温度也低。本研究使用含新芒果苷386 μg/ml、芒果苷371 μg/ml、知母皂苷BⅡ 867.2 μg/ml、宝藿苷Ⅰ 84.8 μg/ml、知母皂苷AⅢ 160 μg/ml的混合对照品溶液，考察了漂移管温度分别为80、90、100 ℃时各待测物质的响应值，结果表明当漂移管温度为90 ℃时各物质峰面积响应值均较大，信号噪音比率最大，适合分析，因此最终漂移管温度采用90 ℃。结果如图3所示。

本研究建立了一种同时测定知母药材中包括芒果苷、知母皂苷BⅡ在内的5种活性成分含量的HPLC-ELSD方法。该法快速、简便、准确度高，可为知母的质量评价和质量标准的提升提供科学依据，为知母有效成分的体内动态变化研究提供测定方法。