Study on quality standard for vinegar-steamed Corydalis rhizoma

超声波清洗仪（德国Elma公司）；分析天平（METTLER TOLEDO公司）；多功能振荡器（山东申仪电子科技有限公司）；高温箱型电炉、数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）；普利菲尔超纯水机（上海富诗特仪器设备有限公司）；赛默飞U3000系列液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）。

本实验共收集10批延胡索药材，经海军军医大学药学系中药鉴定学教研室张成中老师鉴定为罂粟科植物延胡索的干燥块茎。延胡索乙素（中国食品药品检定研究院，批号：110726-201516，纯度：99.8%）；食用醋（江苏恒顺醋业股份有限公司）；自制超纯水；色谱级甲醇、氨水（国药集团）。

取净制、切制后的延胡索，大小分档，加醋拌匀、润透，置蒸制容器内，用蒸汽加热蒸透、内无硬心，取出，干燥。炮制操作主药与辅料按延胡索与米醋的质量比为100∶20(kg/kg)制备醋蒸延胡索。

取10批醋蒸延胡索分别编号为CYHS-01-01～10，观察其大小、形状、色泽、质地、气、味等总结其共性特征。本品呈不规则的圆形厚片，表面黄褐色，有不规则网状皱纹。质硬而脆，断面黄褐色，角质样，有蜡样光泽。微具醋香气，味苦。

取醋蒸延胡索粉末1 g，参照《中国药典》（一部）2015年版延胡索薄层鉴别项下制备供试品溶液。另取延胡索对照药材l g，同法制成对照药材溶液。再取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每l ml含0.5 mg 的溶液，制成对照品溶液。吸取上述3种溶液各2～3μl分别点于用1%氢氧化钠溶液制备的同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-丙酮（9∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中显色约3 min后取出，待板上吸附的碘挥尽后，置紫外光灯（365 nm）下检视。从色谱图上可以看出，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点和荧光斑点（图1）。

参照《中国药典》（四部）2015年版0832水分测定法第二法共测定10批次醋蒸延胡索饮片，水分最低值11.87%，最高值15.74%（表1），根据数据及公式μ=$ \bar x $+ ts/$\sqrt{n} $+MU[注：$\bar x $是样本的平均数；t是置信水平为99%的学生t检测值(单尾)；s是样本的标准偏差；n是样本的批数；MU是不确定度评估（MU=0.1270×$\bar x $）]计算，限度应为15.61%，参照《中国药典》（一部）2015年版延胡索项下，拟定水分限度不得超过15.0%。

参照《中国药典》（四部）2015年版2302灰分测定法共测定10批次醋制延胡索饮片，总灰分最低值2.77%，最高值3.80%（表2），根据数据参照《中国药典》（一部）2015年版延胡索项下，根据公式μ=$\bar x $+ts/$\sqrt{n} $+MU计算，限度应为：3.53%，参考《中国药典》（一部）2015年版延胡索项下总灰分限度，拟定不得超过4.0%。

按照《中国药典》（四部）2015年版2201醇溶性浸出物测定法热浸法，用稀乙醇作溶剂，共测定10批次醋延胡索浸出物， 10批醋延胡索的浸出物在11.68％～18.20％之间（表3）。以统计学方法分析测试数据, 基于测试数据, 设定浸出物限度的公式如下：μ=$\bar x $−ts/$\sqrt{n}$−MU（其中，$\bar x $是样本的平均数；t是置信水平为99%的学生t检测值（单尾）t_0.01,9=2.821；s是样本的标准偏差；n是样本的批数；MU是不确定度评估MU=0.1413×$\bar x $）。浸出物测定限度为：10.41%。拟定醇溶性浸出物测定法，参照《中国药典》2015年版（四部）2201测定，用稀乙醇作溶剂，浸出物不得少于11.0%。

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺调pH至6.0）（55∶45）为流动相；检测波长为280 mn。理论板数按延胡索乙素峰计算应不低于3 000。

取P₂O₅减压干燥12 h后延胡索乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含46 μg的溶液，即得。

取醋蒸延胡索粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入浓氨试液-甲醇（1∶20）混合溶液50 ml，称定重量，浸渍1 h后加热回流1 h，放冷，再称定重量，用浓氨试液-甲醇（1∶20）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 ml，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取延胡索乙素对照品溶液与醋蒸延胡索供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得（图2、图3）。

精密称取纯度为99.8%的延胡索乙素对照品适量置50 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液储备液，分别精密量取一定量的对照品储备液稀释成浓度分别为0.0101、0.0202、0.0404、0.0809、0.1213、0.1618 mg/ml的对照品溶液，注入液相色谱仪，测定含量，以浓度为纵坐标、峰面积为横坐标得标准曲线Y=931.64X+5.1405 (r=0.99995)。

取CYHS-01-010样品约0.5 g，精密称定，按供试品溶液制备方法处理，测定含量，平行取样测定6次，计算每次测定延胡索乙素的含量为0.097%，RSD为2.4%，符合要求。

精密称取延胡索乙素对照品溶液10 μl注入液相色谱仪，测定峰面积，平行测定8次，计算RSD为1.1%，符合要求。

取CYHS-01-010样品约0.5 g，精密称定，按供试品溶液制备方法处理，分别在0、2、4、6、8、12、24 h测定含量，计算每次测定延胡索乙素的RSD为1.8%，符合规定。

取CYHS-01-010样品约0.25 g，精密称定，精密加入含延胡素乙素0.202 2 mg的对照品溶液，按供试品溶液制备方法处理，得相关溶液，进液相色谱仪处理，计算含量及加样回收率，理论要求加样回收率85%～110%（CYHS-01-010含量为0.097%），RSD<5%（表4）。

测定10批样品，根据数据计算，结果参照《中国药典》（一部）2015年版延胡索项下制订，拟定含量限度为：不得少于0.050%（10批检品含量差别不大，最大值与最小值差别接近1倍），见表5。根据公式μ=$\bar x $-ts/$\sqrt{n} $-MU计算，限度应不得少于0.060%，醋蒸为醋制延胡索的一个炮制规格，结合《中国药典》（2015年版）一部延胡索项下的含量限度，设定按干燥品计算，延胡索乙素（C₂₁H₂₅NO₄）不少于 0.050%。

辛、苦、温，归肝、脾经。具有活血，行气，止痛之功。性味与归经、功能与主治、用法与用量、储藏等项目参照现行版《中国药典》（一部）2015年版延胡索项下制定。

蒸法炮制药材早在2000多年前的医药文献《五十二病方》中就有“陈藿，蒸而取其汁”记载，汉代张仲景的《伤寒论》中有“乌梅...蒸之”，至明代缪希雍《炮炙大法》中已有近百味药材的蒸制记载。蒸法的广泛应用使其成为中药炮制最常用的炮制工艺之一。中药延胡索的炮制在宋代出现了醋炒、醋煮、盐炒等工艺，及至明清时又出现了醋纸煨、酒煮等工艺，延胡索醋蒸始载于明代《本草乘雅半偈》“醋润，蒸之，从巳至亥，俟冷取出，焙干，研细用”。现在主要炮制方法为醋炙、醋煮、酒炙、醋蒸等，醋蒸延胡索临床上虽广泛应用，但尚缺法定质量标准。

延胡索经过醋炙后，饮片中延胡索乙素的含量较醋炙前变化较小，但醋炙后延胡索煎剂中延胡索乙素的含量变化较大，溶出会显著增加，表明延胡索醋制后大量生物碱和醋酸反应生成生物碱盐，可提高煎出量，继而提高延胡索止痛作用^[8-9]。江国荣等将延胡索生品分别经醋炙、醋煮、醋烘、酒炙后，测定生物碱的含量，发现延胡索经不同炮制后生物碱含量均有所升高，说明临床上可以根据治疗需要，对延胡索采用醋烘、醋炙、酒炙等炮制方法来提高有效成分的含量^[10]。李春等采用正交试验法优化延胡索醋蒸炮制工艺，以延胡索粗粉为原料，加醋量30%，闷润2 h，蒸制2 h后，延胡索乙素的含量明显提高^[11]。郑军献等对新采集的延胡索进行加工炮制，发现通过不同炮制方法制备延胡索药材，水煮法、蒸制法、烘干法在外形、性状基本一致，但延胡索乙素及成品折干率相差较大，蒸制延胡索乙素含量比水煮高出16.35%，成品折干率比煮法高出3.52%，说明蒸制法优于水煮法。蒸制时间10 min，延胡索乙素含量达到最高，当蒸制时间延长时，其含量反而降低^[12]。龙全江等研究发现，经煮制加工的延胡索药材样品中3 种生物碱的含量总体低于蒸制加工所得的延胡索药材，其结果为延胡索药材蒸制炮制工艺的确定提供了物质基础和研究依据 ^[13]。

在现有文献的基础上，经实验研究分析，醋蒸延胡索具备现行版《中国药典》一部收载的醋炙延胡索质量要求，且延胡索乙素的含量明显高于药典中醋炙延胡索的要求，延胡索乙素可以作用于中枢神经系统，止痛、镇静，降低成瘾性、保护大脑的作用；也可以作用于心血管系统，抗心律失常、改善血流动力学、降低血脂^[14]。延胡索乙素含量的增加符合醋制增强行气、止痛之功的炮制目的。因此制定醋蒸延胡索质量标准要求应为：性状为不规则的圆形厚片，表面黄褐色，有不规则网状皱纹。质硬而脆，断面黄褐色，角质样，有蜡样光泽，微具醋香气，味苦；水分不超过15%；总灰分不超过5%；以稀乙醇作溶剂，浸出物不少于11.0%；延胡索乙素（C₂₁H₂₅NO₄）含量，按干燥品计算不少于 0. 050%。