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天然环肽auyuittuqamide A的全合成研究

耿晨晨 汪甜甜 李翔 王小彦 姜云云

耿晨晨, 汪甜甜, 李翔, 王小彦, 姜云云. 天然环肽auyuittuqamide A的全合成研究[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(1): 53-56, 61. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105087
引用本文: 耿晨晨, 汪甜甜, 李翔, 王小彦, 姜云云. 天然环肽auyuittuqamide A的全合成研究[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(1): 53-56, 61. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105087
GENG Chenchen, WANG Tiantian, LI Xiang, Wang Xiaoyan, JIANG Yunyun. The total synthesis of natural cyclopeptide auyuittuqamide A[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(1): 53-56, 61. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105087
Citation: GENG Chenchen, WANG Tiantian, LI Xiang, Wang Xiaoyan, JIANG Yunyun. The total synthesis of natural cyclopeptide auyuittuqamide A[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(1): 53-56, 61. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105087

天然环肽auyuittuqamide A的全合成研究

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105087
基金项目: 无锡市科技卫生指导性项目,锡科计(2018)255号
详细信息
    作者简介:

    耿晨晨,硕士研究生,研究方向:多肽合成研究,Email:gcc0315@126.com

    通讯作者: 王小彦,硕士研究生,健康教育科副科长,研究方向:临床药学,Email:554036846@qq.com姜云云,博士,副主任药师,研究方向:医院药学,Email:20791374@qq.com
  • 中图分类号: R914

The total synthesis of natural cyclopeptide auyuittuqamide A

图(5)
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-05-19
  • 修回日期:  2021-09-22
  • 网络出版日期:  2022-01-20
  • 刊出日期:  2022-01-25

天然环肽auyuittuqamide A的全合成研究

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105087
    基金项目:  无锡市科技卫生指导性项目,锡科计(2018)255号
    作者简介:

    耿晨晨,硕士研究生,研究方向:多肽合成研究,Email:gcc0315@126.com

    通讯作者: 王小彦,硕士研究生,健康教育科副科长,研究方向:临床药学,Email:554036846@qq.com姜云云,博士,副主任药师,研究方向:医院药学,Email:20791374@qq.com
  • 中图分类号: R914

摘要:   目的  用Fmoc固相直链合成和液相环合的方法合成天然环肽auyuittuqamide A。  方法  以2–氯三苯甲基氯(CTC)树脂为固相载体,1,3–二异丙基碳二亚胺(DIC)和1–羟基苯并三氮唑(HOBT)为缩合剂,9–芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护的氨基酸,按照序列依次缩合,以三氟乙醇(TFE)作为切割试剂,获得全保护直链肽。以六氟磷酸苯并三唑–1–基–氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)和1–羟基苯并三氮唑(HOBT)为环合试剂,全保护直链肽在二氯甲烷(DCM)溶液中环合,以三氟乙酸(TFA)为脱保护试剂,获得天然环肽auyuittuqamide A。用高效液相制备色谱进行纯化,采用HR-Q-TOF-MS, 500MHz 1H-NMR进行表征分析。  结果  获得纯度大于95%的天然环肽auyuittuqamide A,总收率5.48%。  结论  此法合成步骤简单,产率较高,首次建立天然环肽auyuittuqamide A的全合成方法,为auyuittuqamide A的进一步研究奠定基础。

English Abstract

耿晨晨, 汪甜甜, 李翔, 王小彦, 姜云云. 天然环肽auyuittuqamide A的全合成研究[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(1): 53-56, 61. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105087
引用本文: 耿晨晨, 汪甜甜, 李翔, 王小彦, 姜云云. 天然环肽auyuittuqamide A的全合成研究[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(1): 53-56, 61. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105087
GENG Chenchen, WANG Tiantian, LI Xiang, Wang Xiaoyan, JIANG Yunyun. The total synthesis of natural cyclopeptide auyuittuqamide A[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(1): 53-56, 61. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105087
Citation: GENG Chenchen, WANG Tiantian, LI Xiang, Wang Xiaoyan, JIANG Yunyun. The total synthesis of natural cyclopeptide auyuittuqamide A[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(1): 53-56, 61. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105087
  • 环肽主要源于植物、真菌,以及海洋天然产物和绝大多数生物有机体中[1]。环肽是具有特殊的生物活性和较强的药理活性的一类化合物[2-3]。而且大多数环肽结构比直链肽更加稳定,且脂溶性高、穿膜性强、体内半衰期长等优点[4-5],从而使环肽在抗肿瘤、抗病毒、天然领域中起着重要的作用[6-9]

    Auyuittuqamide A是从极地海洋天然产物微孢子菌属(RKAG186)中分离得到的一种环肽化合物,它是由10个氨基酸残基组成。Russell等[10]Sesquicillium microsporum中分离得到四个环十肽auyuittuqamide A-D。该类肽有一定的天然活性和对人体低毒性[11-12]。auyuittuqamide A经过核磁共振光谱法和串联质谱法证明了这类化合物的结构。用Marfey法[13]确定了氨基酸的绝对结构。然而,天然产物中分离提取的auyuittuqamide A的含量很低,很难推进构效关系和下一步的研究与应用。因此,采用固相合成法合成环十肽具有成本低、时间短、操作简单等优点[14-16]

    本文用2–氯三苯甲基氯(CTC)树脂为固相载体,通过HOBT/DIC为缩合体系,依次缩合氨基酸,完成全保护直链肽的合成。再以PyBOP/HOBT/DIPEA为缩合体系,在DCM溶液中液相环合[17-19],随后利用TFA进行保护基的脱除,进而得到环十肽auyuittuqamide A(图1)。

    图  1  Auyuittuqamide A的结构式

    • Fmoc-L–亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、Fmoc–甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)、Fmoc-L–缬氨酸(Fmoc-Val-OH)、Fmoc-O–叔丁基–L–丝氨酸(Fmoc-Ser(tBu)-OH)、Fmoc-L–异亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)、N-(9–芴甲氧羰酰基)-N–甲基–L–苯丙氨酸(Fmoc-N-Me-L-Phe-OH)、Fmoc-N–甲基–L–缬氨酸(Fmoc-N-Me-L-Val-OH)、N-Fmoc-N–甲基–O–叔丁基–L–苏氨酸(Fmoc-N-Me-Thr(tBu)-OH)[希施生物科技(上海)有限公司];2–氯三苯甲基氯(CTC)树脂(上海吉尔生化有限公司);N,N–二异丙基乙胺(DIPEA)、六氟磷酸苯并三唑–1–基–氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、1–羟基苯并三氮唑(HOBT)、1,3–二异丙基碳二亚胺(DIC)、三氟乙醇(TFE)、三氟乙酸(TFA)购自北京百灵威科技有限公司;N,N–二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)(国药集团化学试剂有限公司);乙腈为色谱纯。

      CHA-S气浴恒温振荡器(江苏金坛国胜实验仪器厂);SK7200BT超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司);LD5-2A低速离心机(北京京立离心机有限公司);低温恒温反应浴(槽)、SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(上海东玺制冷仪器设备有限公司);WSZ-50A轨道式振荡器(上海-恒科技有限公司);Waters2695/E2695高效液相色谱仪(美国沃特世公司);LC-1型反向制备液相色谱仪(北京创新恒通科技有限公司);6538 UHD Accurate Mass Q-TOF LC/MS质谱仪(美国安捷伦公司)。

    • 图2路线,固相合成天然环肽auyuittuqamide A。

      图  2  Auyuittuqamide A的合成路线

    • 用称量纸称取2–氯三苯甲基氯(CTC)树脂1 g(载样量为0.45 mmol/g)于多肽固相合成反应管中,加入DCM(10 ml)和DMF(10 ml)溶胀树脂,20 min后抽干。用DMF和DCM冲洗5遍,加Fmoc-Gly-OH(600 mg,2 mmol)和DIPEA(666 μl)的DMF溶液入反应管中,反应管固定于CHA-S气浴恒温振荡器中常温震荡4 h。再用DCM和DMF各洗涤5遍,抽干之后再加入20%哌啶的DMF溶液(10 ml),重复2遍,每一遍10 min,从而脱去氨基酸上的Fmoc保护基,再依次使用DMF和DCM各洗涤5遍。之后将已经配置好的Fmoc–氨基酸–OH(2 mmol,5倍当量),HOBT(2 mmol,5倍当量),DIC(2 mmol,5倍当量)的DMF溶液加入到反应管中,反应管固定于CHA-S气浴恒温振荡器中常温震荡2 h,反应完成之后,再使用DMF和DCM冲洗5遍。重复上述步骤,依次偶联氨基酸Fmoc-N-Me-L-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-N-Me-L-Phe-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-N-Me-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH。

    • 所有氨基酸完成偶联之后,获得直链肽–树脂复合物,使用无水乙醚将其挥干,加入TFE/DCM(1∶4,V/V)混合溶液10 ml,放置在轨道式振荡器,常温震荡4 h。过滤并收集滤液,滤液用旋转蒸发仪蒸干,获得直链肽粗品,粗品用制备型RP-HPLC进行纯化,再使用冻干机将其干燥,获得纯品直链肽。

    • 在0 ℃的条件下将直链肽溶于50 ml的DCM溶液缓慢滴加入HOBT(3 eq)、PyBOP(5 eq)、DIPEA(10 eq)溶于DCM 50 ml中,滴加完成之后,于常温搅拌反应过夜。反应结束后,使用旋转蒸发仪蒸干反应溶剂,获得目标粗品,再将粗品用制备型RP-HPLC纯化,再使用冻干机将其干燥,获得纯品环肽。

    • 先配置脱除侧链保护基溶液12 ml(TFA/DCM=1/3),将溶液加入到环肽冻干后的纯品中,固定于轨道式振荡器,常温震荡反应4 h。

    • 色谱条件:Ryoung C18色谱柱(20mm×250 mm,10 μm);流动相A:水+0.1%TFA,流动相B:乙腈+0.1%TFA,梯度洗脱:(0~5 min, 40% B;5~60 min,40%~70% B);流速:20ml/min; 紫外检测波长214 nm。

    • 本步是将直链肽从树脂上切割,得到油状物粗品360 mg,再将粗品进行纯化,得到纯品100 mg,收率为:[实际值100mg/(理论值1144×0.45 mmol)]×100%=19.42%,HPLC图谱如图3所示,HR-Q-TOF-MS质谱图中对应的[M+H]+峰1145.7444,[M+Na]+峰1167.7266显示的分子量与直链肽auyuittuqamide A相吻合。

      图  3  Auyuittuqamide A全保护直链肽HPLC (A)和HR-Q-TOF-MS (B)谱图

      本步是将直链肽纯品进行环合,得到油状物粗品,再将粗品进行纯化,得到纯品30 mg,此步收率为:[实际值30mg/(理论值1126×0.45 mmol)]×100%=5.92%,HPLC图谱如图4所示,HR-Q-TOF-MS质谱图中对应的[M+H]+峰1127.7346,[M+Na]+峰1149.7159显示的分子量与auyuittuqamide A直链肽环合后分子量相吻合。

      图  4  直链肽环合后HPLC (A)和HR-Q-TOF-MS (B)谱图

      本步是将环合后纯品脱除侧链保护基,得到油状物粗品,再用乙腈和水溶解,最后冻干得到纯品25 mg,收率为:[实际值25mg/(理论值1014×0.45mmol)]×100%=5.48%,HPLC图谱如图5所示,HR-Q-TOF-MS质谱图中对应的[M+H]+峰1015.6115,[M+Na]+峰1037.5937显示的分子量与环肽auyuittuqamide A分子量相吻合。

      图  5  Auyuittuqamide A纯品的HPLC(A)和 HR-Q-TOF-MS(B)谱图

    • 本研究通过500MHz核磁共振氢谱对环肽进一步表征,确认与文献中auyuittuqamide A的核磁共振氢谱相符。1H-NMR (500MHz, d-DMSO) δ: 8.91 (d, J = 9.85 Hz, 1H), 8.70 (d, J = 9.5Hz, 1H), 8.55 (d, J = 6.95 Hz, 1H), 7.75 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.47−7.43 (m, 3H), 7.27−7.17 (m, 5H), 5.01 (d, J = 9.75 Hz, 1H), 4.88 (m, 1H), 4.59−4.52 (m, 2H), 4.45 (t, J = 9.15 Hz, 1H), 4.39 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 3.32 (dd, J = 4.3 Hz, 1H), 3.88−3.82 (m, 2H), 3.78 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.74 (d, J = 4.45 Hz, 1H), 3.33−3.27 (m, 4H), 3.22 (s, 3H), 3.17−3.13 (m, 4H), 2.98−2.93 (m, 1H), 2.48−2.45 (m, 7H), 1.97 (m, 1H), 1.87−1.82 (m, 2H), 1.64−1.60 (m, 2H), 1.20−1.13 (m, 3H), 1.01 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 5.75 Hz, 3H), 0.82−0.78 (m, 17H), 0.76−0.72 (m, 5H), 0.70 (d, J = 6.45 Hz, 3H)。

    • 本法采用先固相合成直链肽,再液相进行环合获得目标产物auyuittuqamide A。并且采用先环合,再脱除侧链保护基,从而有效地避免了侧链裸露的羟基对环合时的影响[20]。使用高效液相色谱进行纯化,得到纯品纯度大于95%,收率为5.48%的目标产物auyuittuqamide A。本研究首次完成了对auyuittuqamide A的全合成,本法优点:更为省时,方法简单,易于操作,且经济实用。缺点:产率还有待提高,方法需进一步优化。总的来说,本方法为该类环肽化合物的全合成提供了参考。

参考文献 (20)

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