Determination of four different components in Danggui Liuhuang decoction by HPLC/MS/MS

LC-20A高效液相色谱仪（岛津）、QTRAP® 4000（AB Sciex）、VORTEX GENIUS 3涡旋仪（IKA）、Milli-Q纯水仪（Merck Millipore）、MD 200氮气吹干仪（CHINCAN）、New Classic MF电子天平（万分之一，METTLER TOLEDO）、Z216MK高速温控离心机（HERMLE）。

盐酸黄柏碱（批号：5436），盐酸巴马汀（批号：8103），毛蕊异黄酮（批号：7851），阿魏酸（批号：8042），以上4种对照品的质量分数均≥99%，均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。甲醇（质谱级，99.9%，默克）和乙腈（质谱级，99.9%，默克），甲酸（色谱级，≥98%，赛默飞世尔科技（中国）有限公司），水为Milli-Q纯水仪去离子水。当归六黄汤中各单味药材均购自复旦大学附属肿瘤医院草药房，包括：当归（批号：20210615、20210705-1、20210723产自甘肃）、生地黄（批号： 20201217-1、20210324-1、20210401-1，产自河南）、熟地黄（批号：200801、210702、210801，产自河南）、黄连（批号：201101、210310、210601，产自四川）、黄柏（批号：210106、210605、210803，产自辽宁）、黄芪（批号：20200926-1、20201010-1、20210318-1，产自内蒙）、黄芩（批号：20201219-1、20210104-1、20210603-1，产自陕西）。

分别精密称取4个对照品（黄柏碱、巴马汀、毛蕊异黄酮、阿魏酸），用甲醇分别配制成浓度约 10 mmol/ml 的对照品溶液，取各对照品液100 μl混合均匀，加甲醇至1 ml制备成浓度为1 mmol/ml的混合对照品储备液，-20 ℃密封保存备用。

精密量取100 μl混合对照品储备液，首先稀释为100 μmol/ml的标准溶液，之后逐级稀释为2 μmol/ml、0.5 μmol/ml、0.2 μmol/ml、50 nmol/ml、20 nmol/ml、10 nmol/ml、5 nmol/ml、2 nmol/ml的系列标准曲线浓度。

样品制备方法参照文献并根据实际用量进行调整^[17]：分别称取当归1 g，地黄 1 g，熟地黄1 g，黄芩1 g，黄连1 g，黄柏1 g，黄芪2 g，粉碎过20目筛后，置于250 ml圆底烧瓶中，加入10倍（V/W）体积的超纯水室温浸泡1 h，回流提取30 min，过滤收集滤液，超纯水补足体积至80 ml，随后取滤液2 ml于50 ml容量瓶，加入超纯水至刻度，获得复方供试品溶液。分别称取上述各单味药材5 g，并分别粉碎过20目筛后，按照上述方法分别进行回流提取，获得各单味药材的供试品溶液。分别取复方供试品溶液和各单味药材供试品溶液稀释10倍后进样。

Agilent Extend-C₁₈色谱柱（5 μm, 4.6 mm×250 mm），流速为0.3 ml/min，进样体积为10 μl，柱温为25 ℃，流动相：0.5%甲酸水溶液（A），甲醇（B）。洗脱梯度：0 min为15% B，5 min为50% B，12~20 min为95% B，20.1~35 min 为15% B。

离子源为ESI源，雾化气压GS1：60 psi，辅助气压：60 psi，喷雾电压：4 500 V（正离子模式），温度：500 ℃。采集模式：多反应监测模式(MRM)，阿魏酸离子对：m/z 195.3-145.1，保留时间24.03 min；巴马汀离子对：m/z 352.4-336.1，保留时间23.15 min；毛蕊异黄酮离子对：m/z 285.2-270.0，保留时间25.79 min；黄柏碱离子对：m/z 342.4-192.2，保留时间19.85 min。

在定量分析中，对建立的分析方法进行验证是保证测定可靠、数据可信的必要条件。方法验证主要包括以下几个方面。

选取20 nmol/ml浓度的混合对照品溶液进样，4种成分的总提取离子流色谱图见图1A。当过六黄汤复方供试品溶液的提取离子流色谱图见图1B。黄柏碱的提取离子流色谱图见图1B，巴马汀提取离子流色谱图见图1C，阿魏酸提取离子流色谱图见图1D，毛蕊异黄酮提取离子流色谱图见图1E。方法的专属性能够满足对中药复方主要成分的定量分析要求。

按“2.1.2”制备一系列浓度梯度的混合对照品溶液后，由低浓度依次进样。方法的灵敏度较高，在黄柏碱浓度2 nmol/ml，巴马汀浓度20 nmol/ml、黄连碱浓度20 nmol/ml、小檗碱浓度20 nmol/ml的样品中，测得信噪比远大于10，能够满足对样品含量测定的要求。将药物峰面积和浓度之间进行线性回归，得到的标准曲线、线性范围如表1，相关系数r在 0.992 0~0.999 6之间。

精密吸取50 nmol/ml混合对照品溶液10 μl ，连续进样6次，记录峰面积。结果显示：阿魏酸、巴马汀、毛蕊异黄酮、黄柏碱峰面积的RSD分别为1.14%、1.94%、2.09%、1.33%（n=6）。连续进样3 d，结果显示，阿魏酸、巴马汀、毛蕊异黄酮、黄柏碱峰面积的RSD分别为1.96%、2.83%、1.85%、2.15%（n=3），表明方法的精密度良好。

精密称取同批次当归六黄汤复方粉末6份 ，每份1.0 g，参照“2.1.3”项下方法平行制备供试品溶液后进样，测定4种成分的含量。结果显示：阿魏酸、巴马汀、毛蕊异黄酮、黄柏碱含量的RSD分别为1.89%、3.53%、2.12%、1.49%（n=6），表明方法的重复性良好。

分别精密吸取“2.4”项下供试品溶液，于室温放置0、4、8、12、16、20、24 h进样测定，记录峰面积。结果显示，阿魏酸、巴马汀、毛蕊异黄酮、黄柏碱峰面积的RSD分别为0.96%、1.25%、1.21%、1.07%（n=7），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定。

取已知含量的复方供试品溶液6份，稀释100倍，每份取5 ml。分别精密加入已知浓度的对照品溶液0.5 μmol/ml阿魏酸500 μl、0.5 μmol/ml巴马汀600 μl、0.5 μmol/ml毛蕊异黄酮1 ml、0.1 μmol/黄柏碱500 μl混匀，加水定容至10 ml进样测定，计算加样回收率。结果显示，阿魏酸、巴马汀、毛蕊异黄酮、黄柏碱的平均加样回收率依次为97.74%、98.09%、102.50%、95.05%，RSD 依次为3.09%、2.87%、1.20%、2.14%（n=6），表明方法准确度良好，结果见表2。

选取3批不同批号的单味药材，参照“2.1.3”的方法，制备3批当归六黄汤复方溶液，测定不同批次当归六黄汤4种主要成分的含量。同时制备各单味药材溶液，通过测定单味药材中不同成分的含量明确主要成分的来源。阿魏酸、黄柏碱、毛蕊异黄酮和巴马汀的质量分数见表3。其中，当归、黄柏、黄连中均有阿魏酸，黄柏中阿魏酸含量最高。黄柏碱仅在黄柏中检出，其他单味药中均未检出黄柏碱。黄芩和黄芪中含有毛蕊异黄酮，黄芪中含量较高。黄柏和黄芪中均有巴马汀，黄芪中巴马汀的含量较高。生地黄和熟地黄中均未检出这4种主要成分，相关文献报道地黄中的主要成分为梓醇、糖类、氨基酸、地黄素等^[18,19]。生物碱、有机酸并不是地黄中的主要成分。

采用HPLC法进行样品的在线分离，在建立方法的过程中对色谱中的流动相及洗脱梯度进行考察。甲醇对各成分的洗脱能力较好，并能很好的改善峰形。而且在水相中加入0.5%的甲酸都能够改善生物碱成分的拖尾，在对洗脱梯度进行优化时，最终采用“2.2.1”项下的洗脱梯度，能够实现各组分之间很好的分离并获得较好的峰形。

黄柏碱、巴马汀、毛蕊异黄酮、阿魏酸在质谱分析中，正离子的响应较负离子的响应好，在正离子模式下，以上成分母离子存在形式为[M+H]⁺，通过二级裂解，选取裂解稳定响应较好的离子对进行分析。同时对多反应监测模式下质谱参数DP、CE值进行优化。其中，阿魏酸DP: 55 V，CE: 23 V；巴马汀DP: 76 V，CE: 39 V；毛蕊异黄酮DP: 75 V，CE: 33 V；黄柏碱DP: 66 V，CE: 34 V；使峰形和响应强度达到最优状态。

本文基于当归六黄汤的主要成分建立了HPLC-QTrap的定量分析检测方法，用以定量分析当归六黄汤中的阿魏酸、黄柏碱、巴马汀和毛蕊异黄酮4种主要成分的含量，该方法可用于当归六黄汤的质量控制和评价研究，也能为深入研究中药有效成分在体内的药动学研究提供方法借鉴。