Sedative and hypnotic effects and mechanism of Yening Capsules on mice

体质量为（20±2）g的SPF级雄性ICR小鼠 [常州卡文斯实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK（苏）2016-0010]。动物在温度为（25±2）℃，湿度为（55±10）％的环境中适应性饲养7 d，自由摄取饮用水和标准饲料，保持昼夜节律和环境干净整洁。

夜宁胶囊（中国人民解放军联勤保障部队第904医院院内制剂，批号：20200811）；艾司唑仑片（常州四药，批号：20200111）；戊巴比妥钠（Sigma分装，批号：191201）；生理盐水（四川科伦药业股份有限公司，批号：020100201）；γ-氨基丁酸（GABA）ELISA试剂盒（信裕生物，货号：xy-E12157）；去甲肾上腺素（NE）ELISA试剂盒（Mybiosource，货号：MBS2600834）；多巴胺（DA）ELISA试剂盒（Mybiosource，货号：MBS269234）；5-羟色胺（5-HT）ELISA试剂盒（Mybiosource，货号：MBS266457）。

电子分析天平（XS105型，梅特勒托利多仪器有限公司）；超声波清洗机（FQ-1006HTD型，杭州法兰特超声波科技有限公司）；旋转蒸发器（RE-5C式，上海青浦沪西仪器厂）；电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）； CT-C-O型烘箱（常州市范氏干燥设备有限公司）；自制开野实验敞箱（50 cm×50 cm×30 cm），箱内为黑色，箱底画出25个同等面积的方格；酶标仪（ELX 800型，Bio-Tex）；离心机（80-2型，上海手术器械厂）；可调高速匀浆机（FSH-2A型，常州翔天实验仪器厂）。

夜宁胶囊的制法为：浮小麦加水浸泡2 h，煮沸，于80～90 ℃温浸2次，每次2 h，滤过合并温浸液；灵芝粉碎成粗粉，用95%乙醇浸泡7 d，压榨滤过，滤液减压浓缩干燥，粉碎成细粉，过80目筛，备用；上述灵芝粗粉药渣与合欢皮、首乌藤、大枣、女贞子、甘草加水煎煮滤过，滤液和上述温浸液合并，减压浓缩干燥，碎成细粉，过80目筛，加入灵芝细粉，混匀装胶囊，即得夜宁胶囊，规格400 mg/粒，推荐服用量约10粒/日。按照一个成年人体重60 kg，服用剂量约为60 mg/kg，换算得到小鼠的中剂量约为600 mg/kg。将ICR小鼠随机分成5组（每组10只）：① 空白对照组（相应体积的溶剂灌胃）；② 艾司唑仑组（0.8 mg/kg）；③ 夜宁胶囊低剂量组（YNL，400 mg/kg）；④ 夜宁胶囊中剂量组（YNM，600 mg/kg）；⑤ 夜宁胶囊高剂量组（YNH，800 mg/kg）。每天下午5点灌胃给药，连续灌胃8 d。

在第6 d给药30 min后，将小鼠放置在开野实验敞箱中先适应1 min，待适应时间结束后观察小鼠5 min内自主活动，记录其活动次数，实验过程中保持环境安静。自主活动包括：舔爪、清洗整理身体、擦脸均可记为清洗身体1次；四肢全部进入一格记为水平走格1次；前肢攀附箱壁或离箱底站立记为站立1次。每只小鼠录像结束后需清理敞箱，以免对下一只小鼠造成干扰。

基于前期研究戊巴比妥钠剂量的预实验，选定腹腔注射戊巴比妥钠溶液的阈下剂量为35 mg/kg。在第7 d给药30 min后腹腔注射戊巴比妥钠溶液（35 mg/kg），观察15 min内小鼠睡眠情况，若小鼠翻正反射消失且持续1 min以上认为进入睡眠状态，根据睡眠小鼠只数，计算入睡率。入睡率（%）=进入睡眠动物只数/总动物只数×100％。

基于前期研究戊巴比妥钠剂量的预实验，选定腹腔注射戊巴比妥钠溶液的阈上剂量为41 mg/kg。在第8 d给药30 min后腹腔注射戊巴比妥钠溶液（41 mg/kg），注射后立刻计时并观察，记录小鼠入睡潜伏期和睡眠时长。评判标准：入睡潜伏期指的是小鼠从注射阈上剂量戊巴比妥钠至翻正反射消失的时间；睡眠时长指的是小鼠从翻正反射消失至翻正反射恢复的时间。

行为学实验结束后，在末次给药24 h后脱臼处死小鼠，取出小鼠大脑，用冰冷生理盐水进行冲洗，滤纸吸干后称重。随后匀浆机匀浆（4 ℃），离心10 min（4000 r/min），收集上清液。按照试剂盒说明书操作，采用ELISA法测定小鼠脑组织中GABA、5-HT、DA、NE的水平。

采用SPSS 19.0 软件对实验数据进行分析处理。实验数据组间比较采用单因素方差分析法，组间两两比较采用LSD-t检验；阈下剂量戊巴比妥钠实验数据采用Fisher精确检验分析。实验结果均用（$ \bar{x} $± SEM）表示，当P<0.05时即认为其有统计学意义。

试验结果如表1所示，与空白对照组相比，艾司唑仑组（P<0.05）、YNM组（P<0.05）、YNH组（P<0.01）均显著降低了小鼠自主活动的次数。由此表明，YNM（600 mg/kg）和YNH（800 mg/kg）具有明显的镇静作用。

试验结果如表2所示，与空白对照组相比，艾司唑仑组（P<0.001）、YNM组（P<0.05）、YNH组（P<0.01）的小鼠入睡率显著增加，结果表明YNM（600 mg/kg）、YNH（800 mg/kg）具有明显的镇静催眠作用。

实验结果如表3所示，与空白对照组相比，艾司唑仑组（P<0.01）、YNM组（P<0.05）、YNH组（P<0.01）均显著增加了小鼠的睡眠时长；艾司唑仑组（P<0.05）、YNM组（P<0.05）、YNH组（P<0.05）显著缩短了小鼠的入睡潜伏期。结果表明YNM（600 mg/kg）、YNH（800 mg/kg）具有明显的镇静催眠作用。

各组小鼠脑组织中各神经递质的检测结果如表4所示，与空白对照组相比：艾司唑仑组（P<0.01）和YNH组（P<0.05）小鼠脑组织中GABA含量显著增加；艾司唑仑组（P<0.05）和YNH组（P<0.05）小鼠脑组织中5-HT含量显著增加；艾司唑仑组（P<0.001）和YNH组（P<0.05）小鼠脑组织中DA含量显著增加；艾司唑仑组（P<0.01）和YNH组（P<0.01）小鼠脑组织中NE含量显著增加。结果表明，YNH组（800 mg/kg）能显著性升高小鼠脑组织中的GABA、5-HT、DA和NE水平。

目前临床上治疗失眠的镇静催眠药物主要是以苯二䓬氮类为主的西药，长期服用此类药物不但带来严重的不良反应，还会产生明显的耐受性、依赖性^[5]。而中医药在治疗失眠方面具有疗效好、安全性高和无成瘾性等特点，相较于西药有着独特优势，是目前研究镇静催眠药物的新方向^[6]。夜宁胶囊的主要成分为合欢皮、首乌藤、灵芝、大枣、浮小麦、女贞子、甘草，有安神、养心之功效，用于治疗头昏失眠、神经衰弱、血虚多梦^[7]。其中合欢皮舒肝解郁、悦心安神，用于治疗烦躁不宁、失眠多梦之症；首乌藤养心安神、祛风通络，可治疗阴虚血少而致的虚烦不眠、多梦易惊等症；灵芝利益气血，安神健脾，用于治疗心悸、失眠、虚劳、头晕等症；甘草、大枣补中益气，养血安神，缓和药性；女贞子补肝肾阴；浮小麦敛汗、益气、除热。七味药相互促进、相互依赖，协同发挥了养血安神的作用^[8]。

本文通过建立小鼠开野实验、阈上、阈下戊巴比妥钠协同作用实验等用于考察镇静催眠药物的经典的药理实验模型对夜宁胶囊的镇静催眠作用进行了研究，并进一步考察了夜宁胶囊对小鼠脑内GABA、5-HT、DA和NE等神经递质含量的影响。在研究镇静催眠药物时，开野实验、阈上、阈下戊巴比妥钠协同作用实验均为经典的、可靠的、简单易行的动物模型，而氨基酸类神经递质GABA以及单胺类神经递质5-HT、NE和DA均为公认的参与睡眠-觉醒机制的经典神经递质，当其水平提高时，睡眠质量随之提升^[9-11]。本文研究结果显示，在开野实验中，夜宁胶囊（600、 800 mg/kg）能显著降低小鼠自主活动的次数；在阈上戊巴比妥钠协同作用实验中，夜宁胶囊（600、 800 mg/kg）能明显缩短小鼠的入睡潜伏期、延长小鼠的睡眠时间；在阈下戊巴比妥钠协同作用实验中，夜宁胶囊（600、 800 mg/kg）能显著增加小鼠的入睡率，这表明夜宁胶囊具有显著的镇静催眠作用。进一步研究发现，夜宁胶囊（800 mg/kg）可显著性增加小鼠脑组织中的GABA、5-HT、DA和NE含量。综上所述，夜宁胶囊具有良好的镇静催眠作用，并初步推测其镇静催眠作用机制与GABA、5-HT、DA和NE等神经递质水平改变有关。本研究为夜宁胶囊的开发利用提供了更多的科学依据，在此基础上，其具体的作用机制有待进一步探索研究。