Anti-fatigue activity of selenium nanoparticles functionalized by polysaccharides from Pleurotus tuber-regium sclerotium

SPF级C57/BL6小鼠48只，雄性，6~8周龄，体重20~25 g，由江苏赛业模式生物研究中心（太仓）有限公司提供，生产许可证号：SCXK（苏）2018-0003。于福建中医药大学动物实验中心SPF级动物房内饲养。

PTR-SeNPs：香港理工大学应用生物及化学科技学系黄家兴副教授制备并提供，初始摩尔浓度为1.30 mmol/L；生理盐水：福州海王福药制药有限公司产品；血清尿素氮（BUN）、乳酸（LD）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（CAT）和糖原（Glycogen）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所产品；BCA蛋白浓度测定试剂盒：碧云天生物技术有限公司产品；动物用异氟烷：深圳市瑞沃德生命科技有限公司产品。

5417R低温高速离心机：德国Eppendorf公司产品；LXJ-IIB低速离心机：上海安亭科学仪器厂产品；Th900超低温冰箱：美国Thermo公司产品；DK-S24电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司产品；AR2310电子天平：奥豪斯仪器有限公司产品；M-244超纯水机：德国Milipore公司产品；BCD-216SDN 4 ℃冰箱：中国Haier集团产品；Lab dancer S25涡旋仪：IKA公司产品；M200 Pro多功能酶标仪：瑞士Tecan公司产品；IMS-300全自动雪花制冰机：常熟市雪科电器有限公司产品；BioSpec 70/20 USR小动物核磁共振成像仪：瑞士布鲁克公司产品。

C57/BL6小鼠48只，雄性，6～8周龄，体重20～25 g，在SPF级实验动物房饲养，室内温度为20～26 ℃，相对湿度40%～70%，噪声<60 dB，光照明暗交替12 h/d，所有小鼠适应性喂养1周，待处理。将C57/BL6小鼠分为4组，每组12只，分别为对照组、游泳训练模型组（EC组）、PTR-SeNPs低剂量组[2.5 μmol/（kg·bw），LPTR-SeNPs组]、PTR-SeNPs高剂量组[10 μmol/(kg·bw)，HPTR-SeNPs组]。按所示剂量灌胃21 d，每天给药1次。第1～4天：给药30 min后，适应性游泳训练20 min，连续4 d，第5～7天每天比前1天增加20 min，连续3 d；第8～20天每天游泳80 min，持续13 d。每日监测食物与水的摄取量，并定期记录小鼠体重变化情况（第1、5、10、15和20天）。第21天给药30 min后，每组各取3只，游泳80 min后，MRI扫描小鼠后肢肌肉长度和宽度，其余小鼠进行负重力竭游泳训练后，眼球取血并摘取肝脏，进行疲劳相关生化指标检测（图1）。

第21天给药30 min后，每组各取3只，异氟烷气体麻醉小鼠，MRI扫描小鼠后肢肌肉，利用ImageJ软件分析各组的肌肉长度和宽度，计算各组与对照组之间的比值，即得各组的肌肉相对长度和宽度。

第21天给药30 min后，在尾部绑上重量为小鼠体重5%的铅丝，将其放入水温为（30±2） ℃、50 cm×40 cm×40 cm 的水箱中进行负重力竭游泳测试。适当用玻璃棒搅拌水，或拨弄小鼠，使小鼠一直处于运动状态。小鼠的头部沉下水面8 s不能浮出即判断为力竭，记录每只小鼠从开始游泳至力竭的时间^[19]。每只小鼠测试过后更换新的超纯水，避免小鼠留在水中的警戒物质对其它小鼠产生干扰。负重力竭游泳结束后立即进行眼球取血，脱颈处死，摘取肝脏，保存于−80 ℃，待测。

小鼠眼球取血，3 500 r/min，4 ℃离心15 min，取血清，参照试剂盒说明书检测血清中BLA、BUN、ALT、AST和LDH含量。

取适量肝组织，用生理盐水漂洗，吸净水分，参照试剂盒说明书检测肝脏中SOD、CAT活性和MDA、HG水平。

采用SPSS 23.0软件对实验数据统计分析，以（$ \bar{x}\pm {s} $）表示，采用ANOVA单因素方差分析数据，以P<0.05差异有统计学意义。

MRI扫描小鼠后肢肌肉（图2），ImageJ软件分析并计算各组小鼠后肢肌肉的相对长度和宽度，结果如图3所示。与对照组比较，HPTR-SeNPs能显著增加后肢肌肉相对长度（P<0.05）。结果表明，PTR-SeNPs可通过增加后肢肌肉长度，改变肌肉结构，可能与提高机体的耐力相关。

疲劳是机体复杂的生理变化过程，运动耐力可作为客观直接的判断标准^[20]。由图4A-C可知，与对照组比较，给药21 d后，L/HPTR-SeNPs对运动训练小鼠的体重、摄食和摄水量均无显著影响。小鼠连续灌胃给予PTR-SeNPs 21 d后，通过负重力竭游泳试验考察PTR-SeNPs对小鼠运动性疲劳的影响，结果如图4D所示，与对照组比较，HPTR-SeNPs显著提高小鼠的负重力竭游泳时间（P<0.05）；与EC组或LPTR-SeNPs组比较，HPTR-SeNPs能显著提高小鼠的负重力竭游泳时间（P<0.01），说明PTR-SeNPs可以显著提高小鼠运动耐力，明显缓解小鼠疲劳症状。

糖原作为机体主要的供能物质，运动产生疲劳时，大量ATP被消耗，此时机体糖酵解过程增强，糖酵解过程最终代谢产物为BLA，BLA在机体内大量堆积，使机体内环境呈酸性，细胞正常的能量转换和物质代谢受到影响，最终导致机体产生疲劳^[21-23]。当机体能量消耗达到一定程度，体内的蛋白质开始分解，参与能量代谢，使得血清中BUN含量急剧升高^[24]。小鼠血清BLA含量检测结果如图5A所示，与对照组比较，EC组BLA含量显著升高（P<0.05）；与EC组比较，LPTR-SeNPs组与HPTR-SeNPs组BLA含量显著下降（P<0.05或0.01）。表明PTR-SeNPs可能通过促进葡萄糖更充分氧化分解，减少BLA的生成，或者加快BLA代谢，从而提供更为充足的ATP，减少运动小鼠BLA的蓄积。血清BLA含量检测结果如图5B 所示，与对照组比较，EC组和LPTR-SeNPs组BUN含量显著升高（P<0.01）；而HPTR-SeNPs组的BUN含量则无显著性差异。与EC组比较，HPTR-SeNPs组BUN含量显著下降（P<0.05）。提示PTR-SeNPs可能通过提高葡萄糖的利用，减少蛋白质分解，降低疲劳小鼠血清BUN的生成。

机体在进行剧烈运动时，会生成大量的自由基，使机体产生氧化应激，导致肝脏、心肌和肌肉等组织器官出现受损，血清中ALT、AST和LDH水平亦可作为评价小鼠在游泳应激过程中的敏感指标^[25]。由图6可知，与对照组比较，EC组血清中的ALT、AST和LDH含量显著升高。LPTR-SeNPs组的ALT和LDH含量以及L/HPTR-SeNPs组AST含量均显著升高。与EC组比较，HPTR-SeNPs组ALT水平显著降低（P<0.05），见图6A；L/HPTR-SeNPs组的AST水平显著降低（P<0.05），见图6B；HPTR-SeNPs组的LDH活性水平显著降低（P<0.01），见图6C。结果提示PTR-SeNPs改善运动性疲劳过程中的肝脏生理功能。

机体内含有的多种抗氧化活性酶，如SOD和CAT，可减少体内活性氧自由基的含量，保护肌细胞。抗氧酶活性的提高能够延缓运动疲劳，MDA水平可作为判断机体内物质氧化程度的指标^{[26, 27]}。由图7可知，与对照组比较，HPTR-SeNPs组的CAT活力和HG含量显著升高（P<0.01）。与EC组比较，LPTR-SeNPs组小鼠肝脏中SOD活力和HG含量显著升高（P<0.05），HPTR-SeNPs组小鼠肝脏中CAT活力和HG含量显著升高（P<0.01）。表明PTR-SeNPs可以提高体内SOD、CAT活力，清除体内自由基，减缓小鼠剧烈运动后MDA堆积对肌细胞所造成的损害，同时提高机体HG含量。提示PTR-SeNPs能够显著提高机体的抗氧化应激能力和HG储备能力，从而有效改善运动性疲劳。表明PTR-SeNPs具有增强肝脏生理功能的作用，能有效拮抗游泳训练疲劳的发生。

目前，疲劳已严重影响到人们的身心健康和生活质量，受到了国内外专家的关注，并逐渐成为学者研究的热门课题。硒是生物体中必需的微量元素，在预防癌症、心血管疾病和提高免疫力中具有重要作用。近年来，SeNPs作为一种新型补硒药物出现，具有更好的生物利用度以及更小的毒性^[2]。然而，SeNPs不稳定、极易聚集的性质，限制了其在临床上的应用。近年来，天然生物大分子作为SeNPs的修饰剂，可提高其稳定性和生物活性，并逐渐成为研究热点^[15]。蘑菇多糖具有丰富的羟基，能有效地吸附在SeNPs上，避免其聚积和沉淀^[28]。研究表明，蘑菇多糖修饰的SeNPs其稳定性大幅增强，且具有抗肿瘤、抗氧化、保肝和抗疲劳活性等多种生物活性^[29]。

本研究结果表明，PTR-SeNPs能显著拮抗小鼠的游泳训练疲劳，其抗疲劳作用可能与改善肝脏生理功能、增加糖原储备、减少代谢物堆积及增强机体抗氧化能力有关。因此，深入探究PTR-SeNPs的抗疲劳活性作用机制，为其在抗疲劳药物及保健品的开发应用提供重要的实验参考依据。