Research progress of the effect of flavonoids on cardiovascular and cerebrovascular ischemic diseases

早在1938年，Szent-Gyorgyi等研究发现来自于柠檬的黄酮类化合物橘皮苷具有强化毛细血管的作用，该项功能将有助于改善心脏微循环的水平，从而产生保护作用^[5]。此后，一项名为Zutphen Elderly Study的流行病学研究探讨了膳食类黄酮摄取量与冠心病风险之间的相关性。该研究对65岁至84岁的老年男性黄酮类摄取量进行了统计，结果显示膳食类黄酮摄取量与冠心病引起的死亡之间呈明显负相关，同时与心梗发病率之间也呈弱负相关 ^[6]。在欧洲，荷兰科学家对黄酮醇类和黄酮类摄入量与冠心病死亡率和中风发生率之间做了分析，结果显示摄入量大于30 mg/d者两种疾病的发病风险仅为摄入量最低者的三分之一，且该项调查已排除了高胆固醇、高血压、饮酒、吸烟等心脑血管疾病常见危险因素的影响。而另一项针对饮茶人群的研究表明茶叶中富含的茶叶类黄酮可以很好地预防缺血性心脏病的发生 ^[7]。这些研究均提示我们黄酮类物质可能发挥较强的抗氧化作用，从而降低冠心病的发病率和死亡率。

与心肌缺血类似，缺血性脑卒中同样严重威胁人类的生命健康。而与心肌缺血不同的是，损伤部位是人类神经行为的中枢—脑组织，因此，临床表现更为复杂。黄酮类化合物作为一种常见且重要的中药成分被较多的实验证明其具有抗缺血性脑卒中的作用。

研究表明从中药灯盏细辛中提取出来的黄酮类活性成分灯盏花素可以起到抗脑缺血的作用，其作用主要通过改善血液流变学、缩小脑组织梗死面积以及减少脑海马区域细胞凋亡数来实现^[8-9]。此外，本课题组从传统中药中提取出来的黄酮类活性成分菸花苷，在实验中被证明同样具有确切的保护脑缺血损伤的作用。实验中急性脑缺血的大鼠在注射菸花苷后其生存率较对照组有大幅提升，同时缺血梗死面积显著缩小^[10-11]，在各个时间点对给药组和对照组进行神经行为学评价如mNSS评分、提尾实验等，发现注射菸花苷的大鼠其行为学得分逐渐降低，提示神经功能逐渐趋向好转。此外，该实验还对各组大鼠脑电图和脑组织含水量进行了测定，结果表明，给予菸花苷治疗的大鼠脑电图消失的时间显著延长，同时其脑组织含水量显著降低，改善了脑水肿情况 ^[12]。证实了菸花苷对动物的实验性脑梗塞及缺血后再灌注引起的组织损伤有明显的预防和治疗作用。

研究发现，缺血性心脏病和缺血性脑卒中的病理机制类似，可以归纳为氧化性损伤、钙超载、炎症反应、细胞凋亡及血小板凝集、自噬等。这几种因素之间相互作用，相互影响，形成多个复杂的调控网络，从而造成一系列病理级联反应。而黄酮类化合物可以通过对上述各因素的抑制作用来保护损伤的心肌组织和脑组织。

现代医学研究表明，在心肌缺血发生时，人体内会产生较多的氧自由基，同时机体清除氧自由基的能力下降，使得堆积的氧自由基在心肌细胞中发生过氧化反应，从而破坏心肌细胞的结构和功能，导致心肌缺血进一步加重^[13]。研究发现，超氧化物酶（SOD）作为生物体内清除自由基的首要物质，可减弱氧自由基对细胞造成的损伤，同时还具有修复受损细胞的功能，其活性高低可反映机体清除自由基能力的大小^[14]；丙二醛（MDA）则作为脂质过氧化物反应的产物，常被用于评价机体氧化应激损伤的严重程度^[15]；一氧化氮（NO）是我们熟知的生物体内反应极强的自由基，在机体发生心肌缺血时，该物质在血清中的水平明显下降。实验表明，葡萄籽中富含的原花色素可以有效地清除自由基，从而稳定心肌细胞膜，对心肌产生保护作用^[16-17]。另一项研究以异丙肾上腺素作为诱导的急性心肌缺血大鼠为模型，探索了布渣叶总黄酮对心肌缺血的作用，结果显示，布渣叶总黄酮可明显降低大鼠血清中乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）以及心肌组织中MDA的含量，同时心肌组织中SOD和NO的活性也得到提高^[18]。揭示了黄酮类化合物通过抗氧化作用来产生保护心肌组织的作用。

近年来，氧化应激学说同样也在脑缺血性疾病中被广泛研究。该机制不仅可以直接造成细胞破坏，使脑细胞坏死，还可以通过介导线粒体途径，神经细胞膜结构以及DNA修复酶和转录因子等间接地导致脑细胞凋亡。研究发现，注射天然黄酮类化合物木犀草素的脑缺血大鼠SOD、过氧化氢酶（CAT）活性相较于对照组明显提升，而MDA的含量则显著降低，该结果提示我们木犀草素可以加强机体清除氧自由基的能力，从而产生脑保护作用^[19]。而在另一项体外研究中，中药黄芩中的黄酮类化合物黄芩苷可以抑制外源性和内源性过氧亚硝基阴离子诱导的神经毒性作用，保护人源神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）神经细胞系^[20]。同时，从传统中药红花中提取出来的黄酮类成分菸花苷，也在此前的实验中被证实可以显著降低脑组织中MDA的含量，提高SOD活性^[12]。以上结果表明，黄酮类化合物发挥抗心肌缺血及脑缺血的作用与提高机体抗氧化应激的能力有密切的关系。

炎症反应广泛地存在于各种疾病的病理机制中，其主要通过致炎因子和炎性介质来介导一系列的链式反应。当炎症反应发生在缺血的心肌细胞时，会进一步加剧细胞的缺血和缺氧 ^[21]。在炎症反应中，具有代表性的重要炎症因子有白介素家族，如IL-1β、IL-6以及肿瘤坏死因子(TNF-α)等，这些炎症因子多出现在炎症反应通路的下游，直接影响并加剧炎症反应的发生和发展。而另一种重要的转录因子Kappa-B（NF-κB），作为一种氧化还原敏感因子在炎症反应中同样扮演了重要的角色，其介导的一系列炎症因子如上述的白介素家族、趋化因子、炎性小体等在心肌细胞缺血损伤中起到重要的作用^[22-24]。以往的研究表明，香青兰总黄酮可以抑制心肌缺血大鼠心肌组织中的炎症因子白介素IL-1、IL-6和TNF-α的水平，使炎症因子减少释放，从而降低心肌组织中中性粒细胞的浸润，以达到保护心肌的作用^[25]。另一项研究也发现，银杏黄酮同样可以抑制心肌组织中中性粒细胞的浸润，其作用主要通过下调NF-κB和细胞间黏附因子-1（ICAM-1）的表达来实现^[26]。

与此类似，在机体发生缺血性脑卒中的时候，各类炎症因子依然扮演了重要的角色。研究发现，灯盏细辛在治疗脑梗死时可以显著降低TNF-α、IL-6的含量，从而减轻炎症反应^[27]。在另一项对黄酮类化合物山奈酚的研究中发现，其抗炎作用已在细胞层面得到了证实。它可降低促炎因子的产生和mRNA表达，如胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）、IL-8等^[28]，此外，在以PC12细胞作为研究对象的体外实验中，人们发现加入山奈酚处理后，该组细胞的炎性相关蛋白环氧化酶（COX2），诱导型一氧化氮合酶（iNOS）以及核因子NF-κB水平明显下调，且细胞活力随着的山奈酚的浓度增加而逐步增长；进一步的检测发现，对照组的磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶（P38-MAPK）表达升高，而山奈酚组表达降低，而当加入P38-MAPK抑制剂后发现对照组的炎性相关蛋白水平降低^[29]，该结果提示我们黄酮类化合物山奈酚可以通过抑制P38-MAPK信号通路来对抗机体病理性炎症反应^[30]，进而产生脑细胞保护作用。由此可见，黄酮类化合物主要通过影响炎症因子的表达和释放来发挥抗炎的作用。

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡，是机体为了维持内环境稳定，通过基因控制的细胞自主而有序的死亡，涉及了一系列的基因激活、表达以及调控作用，与各种信号通路、免疫应答以及上述提到的炎症反应有着密不可分的联系。细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的重要病理机制之一。目前与细胞凋亡相关的基因有Bcl-2家族，Caspase家族等，相关通路有NF-κB信号通路、丝裂原活化蛋白激酶MAPK信号通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路等。这些基因同时参与了细胞凋亡的诱发和抑制。在一项研究中发现，我国瑶族传统草药成分铜钻总黄酮可以明显降低已形成心肌缺血再灌注损伤的大鼠心肌组织中Bax蛋白的表达，该蛋白可以促进细胞凋亡，同时实验还发现铜钻总黄酮还可以升高抗凋亡的Bcl-2蛋白的表达，从而抑制细胞凋亡，避免心肌缺血再灌注损伤的进一步加重^[31]。在另一项研究中，科研人员发现来源于印度崖豆的黄酮类化合物不仅可以降低Bax蛋白的表达，升高Bcl-2蛋白的表达，还可以提升心肌组织中结构氮氧化合成酶（cNOS）的活性，同时抑制诱生型一氧化氮合酶（iNOS）活性，从而显著改善心肌缺血再灌注大鼠的心肌组织病理学形态，其实验组的心肌细胞形态、结构和排列较之对照组更为完整和规律^[32]。同时在MAPK信号通路中c-Jun氨基末端激酶（JNK）和P38蛋白激酶可促进细胞的凋亡。研究发现玫瑰中黄酮类化合物可显著下调大鼠心肌组织中磷酸化JNK和P38的表达，从而抑制心肌细胞的凋亡 ^[33]。而另一条重要的信号转导通路PI3K/AKT在细胞的增殖、凋亡、代谢中也发挥了重要的生物学作用，其可抑制细胞凋亡的进程^[34]。其中活化的AKT进入细胞质与细胞核后，可以调节Caspase家族中Caspase-3的表达，同时还可以调节内皮型一氧化氮（eNOS）以及抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax的表达^[35-36]。实验发现，玉郎伞查尔酮可以激活PI3K/AKT信号通路，抑制大鼠心肌细胞的凋亡，从而产生抗心肌缺血的作用^[37]。此外，有研究表明黄芩茎叶总黄酮可以降低发生心肌缺血再灌注损伤的大鼠心肌细胞的凋亡率，其作用可能与降低Caspase-3基因mRNA和蛋白表达有关^[38-39]。

细胞凋亡同时也是缺血性脑卒中发生发展的一个重要病理机制。临床研究发现，认知障碍是缺血性脑卒中发病后的一项重要并发症，它严重影响患者的预后和生活质量。因此，大脑中负责学习记忆和认知的海马区成为了科学家们重点关注的对象。其中CA1区的神经元对脑缺血缺氧较为敏感，容易受到损伤，而CA3区及DG区的神经元则相对耐受^[40]。尼氏体是神经元胞体和树突内的嗜碱性颗粒或小斑块，由游离的核糖体和粗面内质网构成，对缺血变化非常敏锐^[41]。课题组在对黄酮类化合物菸花苷的一项研究中发现，缺血再灌注的大鼠海马区神经元大小不一，胞质不规则淡染，胞核皱缩变形，部分细胞脱失明显，CA1区锥体细胞和 DG区的颗粒细胞排列松散，CA3区锥体细胞排列散乱，表明大鼠发生急性脑缺血再灌注损伤后神经细胞受损严重，与之相比，使用菸花苷处理的MCAO大鼠神经元虽也出现了细胞淡染，大小不均，部分胞体肿胀，CA1区及DG区排列稍显混乱，但整体的形态接近正常，病理损伤明显减轻。同时，在尼氏体方面，模型组整体淡染，皮层的尼氏体大大减少，海马区尼氏体极少，表明造模后神经元功能受到损伤。与模型组相比，菸花苷组皮层尼氏体数目更多，个体更大，染色较均匀，海马区尼氏体虽多为颗粒状，个体稍小，但数目明显增多，说明神经元蛋白合成有所增加，较为活跃^[42]。因此，我们可以得出结论，菸花苷通过促进神经元蛋白的合成，抑制神经细胞的凋亡，保持神经元的活性来提高机体抗脑缺血的功能。同样，黄芩苷在用于脑缺血动物模型时，也可以明显改善实验动物的认识记忆能力^[43]，还通过下调促凋亡基因Bax的表达，下调Bax/Bcl-2的比值，降低COX-2的表达来抑制神经细胞凋亡^[44]。以上研究表明，黄酮类化合物通过抑制细胞凋亡来进一步保护心脑组织免受缺血再灌注的损伤。

研究发现，当心肌发生缺血时，心肌细胞线粒体中Na⁺/K⁺-ATP酶和Ca²⁺-ATP酶活性下降，使线粒体对钙离子的摄入减少，同时包浆内的钠离子含量升高，造成Na⁺ -Ca²⁺交换增加，从而发生钙超载 ，加重心肌缺血的临床症状^[45]。研究发现，玉郎伞黄酮能够提高心肌组织中的Na⁺/K⁺-ATP酶和Ca²⁺-ATP酶活性，减轻细胞内钙离子超载的程度，改善缺血再灌注造成的心肌损伤^[46]；从传统中药香青兰中提取的香青兰总黄酮也可以提高心肌组织中的ATP酶含量，保持线粒体的活性和结构完整性，使其功能得到发挥，从而抑制钙超载的发生^[47]。

在正常的生理状态下，血栓素花生四烯酸（TXA2）与环前列腺素（PGI2）处于一种相对平衡的状态。而在心肌受到缺血再灌注损伤后，该平衡即被打破。此时，心肌内皮细胞受损，导致PGI2合成减少而TXA2作用增强，进一步引起血小板大量聚集，从而加重心肌缺血的程度。研究表明，黄酮类化合物可以发挥抗血小板聚集的作用。如从黄顶茜草中分离出的硫酸黄酮能够阻断TXA2受体而发挥抗血小板凝集的作用 ^[48]。同样的，白桂芦苇中的黄酮类化合物也可以抑制血小板的聚集，从而起到保护心肌的作用^[49]。上述现象的发生机制可能与黄酮类化合物抑制环氧合酶，提高血小板环磷酸腺苷（cAMP）合成，阻断TXA2受体，提高PGI2水平有着直接的联系。

自噬是近几年科学界的一个研究热点，其因开启细胞循环自身物质的新纪元而备受全世界的关注 ^[50-52]。自噬根据发生过程分为三类：巨自噬，微自噬，分子伴侣介导的自噬。目前研究一般集中于巨自噬，其一般过程为：自噬前体的形成，自噬前体延长包裹底物形成自噬小体，自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体最终降解^[53-55]。在脑卒中的发生过程中，自噬起到了关键的保护作用。课题组在MCAO大鼠模型中发现菸花苷可以增加大鼠脑缺血再灌注后缺血半暗带的自噬小体数目，增强LC3的表达，提高活性形式 LC3-II 在LC3表达中所占的比例，增强参与吞噬泡形成的重要相关蛋白 BECN1 蛋白的表达，降低参与自噬溶酶体降解的重要蛋白 SQSTM1 蛋白的表达，降低自噬相关通路雷帕霉素靶蛋白依赖性途径中关键蛋白 phospho-mTOR 的表达，上调 BECN1、Atg7 mRNA 的表达，下调SQSTM1mRNA的表达。由此可知，菸花苷对大鼠脑缺血再灌注后缺血半暗带的自噬水平有促进作用。同时在体外，在人源神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）细胞株上建立模拟体内缺血再灌注的缺复氧模型，结果显示，菸花苷同样可以增加SH-SY5Y细胞内自噬小体的生成，增加LC3的表达，提高自噬体膜标志性蛋白LC3-II表达含量，增强BECN1蛋白的表达，降低SQSTM1蛋白的表达，增强促进细胞内自噬流的进程^{[42, 56]}。由此可知，黄酮类化合物菸花苷可通过自噬来发挥神经保护作用。

黄酮类化合物作为一种常见的天然化合物，存在于自然界的许多植物以及传统中药中。随着科学技术的进步，人们发现这类化合物具有诸多的生物活性，而其强大的药理作用也屡见报道。如降低血管的脆性，改善血管的通透性、降低血脂和胆固醇，防治老年高血压、脑溢血、冠心病、心绞痛、扩张冠状血管，增加冠脉流量等。在这些药理作用中，其抗心脑缺血的作用对于临床上治疗和预防相关疾病显得尤为重要。在上文中，我们列举了许多不同种类的黄酮类化合物在心脑血管疾病中的作用，这些活性成分有的可以直接通过改善血管通透性、缩小梗死组织面积来保护心脑血管组织，有的则通过分子信号通路来产生保护作用。随着研究的推进，它们的作用机制也进一步地得到阐释。可以肯定的是，黄酮类化合物能够为人类治疗和预防心脑血管疾病提供新的治疗思路。当然目前很多实验仅涉及到分子机制中的某个环节，而对于完整的调控过程，精准的作用靶点还有待研究发现。只有通过这一系列系统科学的研究，才能够更好地为心脑血管疾病的治疗提供理论依据，从而进一步在临床得到广泛的应用。